Фенотипическая и функциональная характеристика эндотелиальных колониеобразующих клеток, полученных из человеческой пуповинной крови
Summary
Эндотелиальных клеток, образующих колонии (ECFCs) циркулируют эндотелиальных клетках с надежными клонального пролиферативный потенциал, которые отображают внутренние<em> В естественных условиях</em> Судно формирование способности. Фенотипические и функциональные характеристики результат эндотелиальных клеток, полученных от ЦБ имеют важное значение для выявления и изоляции<em> Добросовестных</em> ECFCs потенциального клинического применения в восстановлении поврежденных тканей.
Abstract
Многолетние виды новых кровеносных сосудов через ангиогенез, васкулогенез и arteriogenesis были недавно рассмотрены 1. Наличие циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников (EPC), впервые были определены в взрослого человека периферической крови Асахара и соавт. В 1997 г. 2 чего приток новых гипотез и стратегий для регенерации сосудистой и ремонт. ЕРС редки, но нормальные компоненты циркулирующей крови, что дома на сайты кроветворения судна или сосудистого ремоделирования, а также содействовать или послеродовой васкулогенез, ангиогенез, или arteriogenesis основном через паракринной стимулирование существующих сосудистой стенки клеток, полученных из 3. Никаких конкретных маркеров для идентификации EPC был определен, и в настоящее время состояние поля, чтобы понять, что многие типы клеток, в том числе проангиогенных гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток, циркулирующих ангиогенных клеток, Tie2 + моноцитов, предшественников миелоидного челLS, опухоли связано макрофагов и М2 активированными макрофагами участвовать в стимулировании процессов ангиогенеза в различных доклинических модельных систем животных и у человека в различных болезненных состояний, 4, 5. Эндотелиальных клеток, образующих колонии (ECFCs) встречаются редко циркулируют жизнеспособные клетки эндотелия характеризуется надежной клонального пролиферативный потенциал, вторичные и третичные колониеобразующих способность на replating и способность образовывать внутренние сосуды в естественных условиях при трансплантации в иммунодефицитных мышей 6-8. Хотя ECFCs были успешно изолированы от периферической крови здоровых взрослых, пуповинной крови (ЦБ) здоровых новорожденных, а стенки сосуда многочисленных человеческих артериальных и венозных сосудов 6-9 ЦБ обладает самой высокой частотой ECFCs 7, дисплей самый надежный клонального пролиферативный потенциал и прочный вид и функциональные кровеносные сосуды в 8 естественных, 10-13. В то время как при выводеECFC от взрослых периферической крови было представлено 14, 15, здесь мы описываем методологию для вывода, клонирования, расширение, и в пробирке, а также в естественных условиях характеристики ECFCs от человеческой пуповинной ЦБ.
Protocol
Discussion
Фенотипические и функциональные характеристики предполагаемого эндотелиальных клеток-предшественников, важно определить добросовестных ECFCs, которые способны клонировании и серийно повторное покрытие в области культуры и привести к прочным и функциональным имплантируемых кро…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Доктор Yoder является консультантом EndGenitor Technologies, Inc и член совета Rimedion Technologies, Inc
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Heparin Sodium Injection, USP | APP Pharmaceuticals | 504031 |
| Ficoll-Pague | Amersham Biosciences | 17-1440-03 |
| Mixing cannula | Maersk Medical | 500.11.012 |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 |
| Defined FBS | Hyclone | SH30070.03 |
| TrypLE express | Gibco | 12605 |
| Rat type I collagen | BD Biosciences | 354236 |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 |
| FcR Block | Miltenyi Biotech | 130-059-901 |
| hCD31, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555445 |
| hCD45, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555482 |
| hCD14, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555397 |
| hCD144, PE conjugated | eBioscience | 12-1449-80 |
| hCD146, PE conjugated | BD Pharmingen | 550315 |
| hCD105, PE conjugated | Invitrogen | MHCD10504 |
| Ms IgG1,k antibody, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555748 |
| Ms IgG1,k antibody, PE conjugated | BD Pharmingen | 559320 |
| Ms IgG2a,k antibody, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555573 |
| Anti-human CD31 | Dako | clone JC70/A |
| Anti-mouse CD31 | BD Pharmingen | 553370 |
| 0.22-μm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU05RE |
| Glacial acetic acid, 17.4N | Fisher | A38-500 |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 |
| IHC Zinc Fixative | BD Biosciences | 550523 |
| Sytox green reagent | Invitrogen | S33025 |
| Cloning cylinders, sterile | Fisher Scientific | 07-907-10 |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Asahara, T. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
- Urbich, C., Dimmeler, S. Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology. Circ. Res. 95, 343-353 (2004).
- Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Isolating and defining cells to engineer human blood vessels. Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).
- Matthias, M., David, N., Josef, N. From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells. Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).
- Ingram, D. A. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105, 2783-276 (2005).
- Ingram, D. A. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104, 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs. J. Vis. Exp. (32), e1525 (2009).
- Au, P. Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels. Blood. 111, 1302-135 (2008).
- Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo. Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).
- Melero-Martin, J. M. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circ. Res. 103, 194-202 (2008).
- Melero-Martin, J. M. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109, 4761-4768 (2007).
- Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524 (2009).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).
- Witting, S. R. Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation. Hum. Gene. Ther. , (2011).
- Yoon, C. H. Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases. Circulation. , 112-1618 (2005).
- Dubois, C. Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).
- Medina, R. J., O’Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).
