Voorbereiding van de myeloïde suppressor cellen (MDSC) van naïeve en pancreas tumor-dragende muizen met behulp van flowcytometrie en geautomatiseerde Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

Summary

Dit is een snelle en uitgebreide methode van immunofenotypering myeloïde suppressor cellen (MDSC) en het verrijken van Gr-1⁺ Leukocyten van muis milt. Deze methode maakt gebruik van flow cytometrie en AutoMACS celsortering te verrijken voor levensvatbare Gr-1⁺ Leukocyten voor FACS sorteren van MDSC voor<em> In vivo</em> En<em> In vitro</em> Assays.

Abstract

MDSC zijn een heterogene populatie van onvolwassen macrofagen, dendritische cellen en granulocyten die zich ophopen in de lymfoïde organen in pathologische aandoeningen, waaronder parasitaire infectie, ontsteking, traumatische stress, graft-versus-host-en vaatziekten, diabetes en kanker ^1-7. Bij muizen, MDSC express Mac-1 (CD11b) en Gr-1 (Ly6G en Ly6C) oppervlakte-antigenen ^7. Het is belangrijk op te merken dat MDSC goed worden bestudeerd in verschillende tumor-dragende hosts waar ze aanzienlijk worden uitgebreid en anti-tumor immuunrespons ten opzichte van naïeve collega's ^7-10 te onderdrukken. Afhankelijk van de pathologische aandoening er verschillende subpopulaties MDSC met verschillende mechanismen en doelen van onderdrukking ^11,12. Doeltreffende methoden levensvatbare MDSC populaties isoleren belangrijk in het ophelderen van de moleculaire mechanismen van onderdrukking in vitro en in vivo.

Onlangs heeft de Ghansah groep heeft gemeld de uitbreiding van MDSC in een muizen alvleesklierkanker model. Onze tumor-dragende MDSC tonen een verlies van homeostase en een verhoogde onderdrukkende functie in vergelijking met naïeve MDSC ^13. MDSC percentages zijn beduidend minder in de lymfoïde compartimenten van naïeve versus tumor-dragende muizen. Dit is een belangrijke voorbehoud dat vaak belemmert nauwkeurige analyse van deze vergelijkende MDSC. Daarom is het verrijken van Gr-1 ⁺ leukocyten van naïeve muizen voorafgaand aan Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) verhoogt de zuiverheid, de levensvatbaarheid en vermindert de soort tijd. Echter, verrijking van Gr-1 ⁺ leukocyten van tumor-dragende muizen is optioneel, omdat deze zijn er in overvloed voor een snelle FACS sorteren. Daarom is in dit protocol beschrijven we een zeer efficiënte methode voor het immunofenotypering MDSC en verrijkende Gr-1 ⁺ leukocyten van de milt van naïeve muizen voor het sorteren van MDSC tijdig. Immunocompetente C57BL / 6 muizen worden geënt met muizen Panc02 ceLLS subcutaan dat de naïeve muizen te ontvangen 1XPBS. Ongeveer 30 dagen na inoculatie; milt worden geoogst en verwerkt tot een cel suspensies behulp van een mobiele dissociatie zeef. Splenocyten worden dan rode bloedcellen (RBC) gelyseerd en een hoeveelheid van deze witte bloedcellen worden gekleurd met behulp van fluorochroom-geconjugeerde antilichamen tegen Mac-1 en Gr-1 tot immunofenotype MDSC percentages met behulp van flowcytometrie. In een parallel experiment worden hele leukocyten van naïeve muizen gekleurd met fluorescent geconjugeerde Gr-1 antilichamen, geïncubeerd met PE-microbolletjes en positief geselecteerde gebruikmaking van een automatische magnetische geactiveerde celsortering (autoMACS) Pro Separator. Vervolgens wordt een hoeveelheid van Gr-1 ⁺ leukocyten gekleurd met Mac-1-antilichamen aan de toename van MDSC percentages met behulp van flowcytometrie te identificeren. Nu deze Gr1 ⁺ verrijkte leukocyten klaar voor het sorteren van FACS MDSC worden gebruikt in vergelijkend analyses (naïeve tegen tumor-dragende) in in vivo en in vitro </em> assays.

Protocol

Voorafgaand aan het starten, de voorbereiding van de volgende oplossingen: 3% kleuring Media (SM): -3% Foetaal runderserum (FBS) in 1X fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) MACS Buffer (MB): – 0,5% runderserum albumine van (BSA) in 1XPBS 1. Oogsten milt van muizen Subcutaan injecteren 6-8 weken oud C57BL / 6 muizen (Harlan) met 1,5 x 10 <su…

Discussion

Dit is een gedetailleerde methode voor de verwerking en immunophentyping MDSC populaties die van toepassing is op verschillende lymfoïde weefsels van verschillende diermodellen. In het bijzonder kan autoMACS verrijking worden gebruikt voor de isolatie van verschillende populaties leukocyten met Gr-1 uitputting van splenocyten ⁴ zuivering van myeloïde subsets van splenocyten en lymfeknopen ⁵ isolatie van beenmerg neutrofielen ¹⁴ en zuivering van CD8 ⁺ T cellen van milt en de …

Materials

REAGENT	COMPANY	CATALOG #	COMMENTS
1X Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific Hyclone	SH30028.02	Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free
Albumin from Bovine Serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906	Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Scientific Hyclone	SV3001403HI	Heat Inactivated; Sterile Environment
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block)	BD Biosciences	553142	Sterile Environment
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC	eBiosciences	11-0112	Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC	eBiosciences	17-5931	Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE	eBiosciences	12-5931	Sterile Environment
DAPI	Invitrogen	D1306	Serial Dilution Sterile Environment
Cell Dissociation Sieve	Sigma-Aldrich	CD1-1KT	Autoclave before use
70-μm strainer	BD Biosciences	352350	Sterile Environment
1X RBC Lysis Buffer	eBiosciences	00-4333-57	Warm to room temperature before use; Sterile Environment
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-12	Sterile Environment
50ml conical tubes	Thermo Scientific	339652	Sterile Environment
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes	BD Biosciences	352054	Known as FACS tubes; Sterile Environment
96-well V-bottom plates	Corning	3897	Sterile Environment
Trypan Blue	Cellgro	25-900-CI	Sterile Environment
PE MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801	Sterile Environment
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
AutoMACS Columns	Miltenyi Biotec	130-021-101
AutoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221