Préparation de dérivés myéloïdes cellules suppressives (MDSC) de Naive et pancréatique souris porteuses de tumeurs par cytométrie en flux et automatisé de tri magnétique de cellules activées (autoMACS)

Summary

C'est une méthode rapide et complète de l'immunophénotypage myéloïdes dérivées des cellules suppressives (MDSC) et l'enrichissement de Gr-1⁺ Leucocytes de la rate de souris. Cette méthode utilise la cytométrie en flux et cellulaire autoMACS tri pour enrichir viable Gr-1⁺ Leucocytes avant tri par FACS du MDSC pour une utilisation<em> In vivo</em> Et<em> In vitro</em> Tests.

Abstract

MDSC sont une population hétérogène de macrophages, les cellules dendritiques immatures et des granulocytes qui s'accumulent dans les organes lymphoïdes dans des conditions pathologiques, y compris les infections parasitaires, l'inflammation, le stress traumatique, réaction du greffon contre l'hôte, le diabète et le cancer ^1-7. Chez la souris, MDSC expresse Mac-1 (CD11b) et Gr-1 (Ly6G et Ly6C) antigènes de surface ^7. Il est important de noter que MDSC sont bien étudiés dans divers porteurs d'une tumeur hôtes où ils sont sensiblement élargies et réprimer les anti-tumoraux des réponses immunitaires par rapport à leurs homologues naïfs ^7-10. Toutefois, en fonction de l'état pathologique, il ya différentes sous-populations de MDSC avec des mécanismes distincts et les cibles de la répression ^11,12. Par conséquent, des méthodes efficaces pour isoler des populations viables MDSC sont importants dans l'élucidation de leurs différents mécanismes moléculaires de la suppression in vitro et in vivo.

Récemment, le Ghansah groupe a signalé l'expansion de la MDSC dans un modèle murin du cancer du pancréas. Notre porteur de tumeurs MDSC afficher une perte de l'homéostasie et augmentation de la fonction suppressive par rapport à naïve MDSC ^13. Pourcentages MDSC sont beaucoup moins dans les compartiments lymphoïdes de souris naïves vs porteur de tumeurs. Il s'agit d'une mise en garde majeure, qui empêche souvent les analyses comparatives précises de ces MDSC. Par conséquent, l'enrichissement de ^Gr-1 + leucocytes chez des souris naïves avant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) améliore la pureté, la viabilité et réduit considérablement le temps de tri. Toutefois, l'enrichissement de la ^Gr-1 + leucocytes de souris porteuses de tumeurs est facultative car ceux-ci sont en abondance pour FACS rapides de tri. Par conséquent, dans ce protocole, nous décrivons une méthode très efficace de immunophénotypage MDSC et enrichissante ^Gr-1 + leucocytes de la rate de souris naïves pour le tri MDSC en temps opportun. Immunocompétents souris C57BL / 6 sont inoculés avec murin Panc02 CElls voie sous-cutanée alors que les souris naïves recevoir 1XPBS. Environ 30 jours après l'inoculation; rates sont récoltées et transformées en une seule cellule suspensions en utilisant un tamis de dissociation cellulaire. Les splénocytes sont ensuite globules rouges (RBC) lysées et une aliquote de ces leucocytes sont colorés en utilisant conjugués au fluorochrome des anticorps contre Mac-1 et Gr-1 à des pourcentages immunophénotype MDSC par cytométrie en flux. Dans une expérience parallèle, les leucocytes entiers de souris naïves sont colorées avec fluorescente conjugués GR-1, incubées avec des anticorps PE-microbilles et sélectionné de façon positive à l'aide un système automatisé de tri magnétique de cellules activées (autoMACS) Pro Separator. Ensuite, une aliquote de GR-1 ^{+ de} leucocytes sont colorés avec Mac-1 anticorps pour identifier les l'augmentation des pourcentages MDSC par cytométrie en flux. Maintenant, ces Gr1 ^{+ de} leucocytes enrichis sont prêts pour tri par FACS du MDSC à être utilisé dans les analyses comparatives (naïve vs porteur de tumeurs) in vivo et in vitro </em> tests.

Protocol

Avant de commencer, préparer les solutions suivantes: 3% de coloration des médias (SM): -3% De sérum bovin foetal (FBS) dans 1X tampon phosphate salin (PBS) MACS tampon (Mo): – 0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans 1XPBS 1. Les rates de récolte provenant de souris Voie sous-cutanée d'injecter 6-8 semaines d'âge C5…

Discussion

Il s'agit d'une méthode détaillée pour le traitement et immunophentyping populations MDSC qui est applicable à différents tissus lymphoïdes de modèles animaux différents. En particulier, l'enrichissement autoMACS peut être utilisé pour l'isolement des différents populations de leucocytes comprenant Gr-1 épuisement des splénocytes ^4, la purification de sous-ensembles à partir de splénocytes myéloïdes et les ganglions lymphatiques ^5, isolement de la moelle osseuse neu…

Materials

REAGENT	COMPANY	CATALOG #	COMMENTS
1X Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific Hyclone	SH30028.02	Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free
Albumin from Bovine Serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906	Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Scientific Hyclone	SV3001403HI	Heat Inactivated; Sterile Environment
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block)	BD Biosciences	553142	Sterile Environment
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC	eBiosciences	11-0112	Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC	eBiosciences	17-5931	Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE	eBiosciences	12-5931	Sterile Environment
DAPI	Invitrogen	D1306	Serial Dilution Sterile Environment
Cell Dissociation Sieve	Sigma-Aldrich	CD1-1KT	Autoclave before use
70-μm strainer	BD Biosciences	352350	Sterile Environment
1X RBC Lysis Buffer	eBiosciences	00-4333-57	Warm to room temperature before use; Sterile Environment
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-12	Sterile Environment
50ml conical tubes	Thermo Scientific	339652	Sterile Environment
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes	BD Biosciences	352054	Known as FACS tubes; Sterile Environment
96-well V-bottom plates	Corning	3897	Sterile Environment
Trypan Blue	Cellgro	25-900-CI	Sterile Environment
PE MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801	Sterile Environment
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
AutoMACS Columns	Miltenyi Biotec	130-021-101
AutoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221