Vorbereitung der Myeloide Suppressorzellen (MDSC) von Naive und Pankreas-Tumor-tragenden Mäusen mittels Durchflusszytometrie und Automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS)
Summary
Dies ist eine schnelle und umfassende Methode der Immunphänotypisierung Myeloide Suppressorzellen (MDSC) und bereichernde Gr-1<sup> +</sup> Leukozyten aus Maus-Milz. Diese Methode verwendet Durchflusszytometrie und autoMACS Zellsortier für tragfähige Gr-1 bereichern<sup> +</sup> Leukozyten vor der FACS-Sortierung MDSC zur Verwendung<em> In-vivo-</em> Und<em> In-vitro-</em> Assays.
Abstract
MDSC sind eine heterogene Population von unreifen Makrophagen, dendritischen Zellen und Granulozyten, die in lymphatischen Organen bei pathologischen Zuständen einschließlich parasitäre Infektionen, Entzündungen, traumatischen Stress, Graft-versus-host-Krankheit, Diabetes und Krebs 7.1 ansammeln. Bei Mäusen, MDSC ausdrückliche Mac-1 (CD11b) und Gr-1 (Ly6G und Ly6C) Oberflächenantigene 7. Es ist wichtig zu beachten, dass MDSC auch in verschiedenen Tumor-tragenden Hosts, wo sie deutlich erweitert werden untersucht und zu unterdrücken Anti-Tumor-Immunantwort gegenüber naiven Kollegen 7-10. In Abhängigkeit von den pathologischen Zustand, gibt es verschiedene Subpopulationen von MDSC mit unterschiedlichen Mechanismen und Ziele der Unterdrückung 11,12. Daher sind wirksame Mittel zur lebensfähigen MDSC Populationen zu isolieren, die Aufklärung ihrer verschiedenen molekularen Mechanismen der Unterdrückung in vitro und in vivo.
Vor kurzem hat die Ghansah Gruppe hat den Ausbau MDSC in einem murinen Pankreaskarzinom-Modell berichtet. Unsere tumortragenden MDSC zeigen ein Verlust der Homöostase und erhöht suppressive Funktion im Vergleich zu naiven MDSC 13. MDSC Prozentangaben sind deutlich weniger in lymphoiden Kompartimente von naiven vs Tumor-tragenden Mäusen. Dies ist eine große Einschränkung, die oft behindert genaue vergleichende Untersuchungen dieser MDSC. Deshalb bereichern Gr-1 + Leukozyten aus naiven Mäusen vor Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) erhöht Reinheit, Viabilität und reduziert Art Zeit. Allerdings ist die Anreicherung von Gr-1 + Leukozyten aus tumortragenden Mäusen optional, da diese in Hülle und Fülle für die schnelle FACS-Sortierung sind. Daher wird in diesem Protokoll beschreiben wir eine hocheffiziente Methode der Immunphänotypisierung MDSC und bereichernde Gr-1 + Leukozyten aus Milzen von naiven Mäusen für die Sortierung MDSC in einer fristgerechten Weise. Immunkompetenten C57BL / 6 Mäusen mit murinem Panc02 ce inokuliertlls subkutan während naive Mäuse erhalten 1XPBS. Etwa 30 Tage nach der Inokulation, Milzen entnommen und in den Single-Zellsuspensionen mit einem Zellabtrennungssiebes verarbeitet. Milzzellen werden dann Rote Blutkörperchen (RBC) lysiert und ein Aliquot dieser Leukozyten angefärbt mit Fluorochrom-konjugierten Antikörper gegen Mac-1 und Gr-1 zu Immunphänotyp MDSC Prozentsätze mittels Durchflusszytometrie. In einem parallelen Experiment, werden ganze Leukozyten aus naiven Mäusen mit fluoreszierenden konjugierten Gr-1-Antikörper, mit PE-Microbeads inkubiert und positiv selektiert mit Hilfe eines automatisierten Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator gefärbt. Als nächstes wird ein Aliquot der Gr-1 + Leukozyten mit Mac-1-Antikörper gefärbt, um die Erhöhung der MDSC Prozentwert mit Durchflusszytometrie zu identifizieren. Nun sind diese Gr1 + angereicherten Leukozyten bereit für FACS-Sortierung von MDSC in vergleichenden Analysen verwendet werden (naiv vs tumortragenden) in in vivo und in vitro </em>-Assays.
Protocol
Discussion
Dies ist eine detaillierte Verfahren zum Verarbeiten und immunophentyping MDSC Populationen, die für verschiedenen lymphoiden Geweben von verschiedenen Tiermodellen ist. Insbesondere kann autoMACS Anreicherung für die Isolierung von verschiedenen Leukozytenpopulationen einschließlich Gr-1 Depletion von Splenozyten 4, Reinigung von myeloiden Teilmengen aus Milzzellen und Lymphknoten 5, Isolierung von Knochenmark Neutrophilen 14 und Reinigung von CD8 + T-Zellen aus der Milz v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir erkennen die USF Durchflusszytometrie Core Facility. Wir möchten Dr. Denise Cooper für den Austausch von Ressourcen zu danken. Wir möchten auch Maya Cohen, Laura Pendleton und Diana Latour für ihre Unterstützung danken, bei der Einrichtung und der Dreharbeiten zu diesem Film. NN von der NSF FG-LSAMP Brücke zur Promotion Fellowship HRD # 0929435 unterstützt. Diese Arbeit wurde von der American Cancer Society Institutional Research Grant # 93-032-13/Moffitt Cancer Center ausgezeichnet zu TG finanziert.
Materials
| REAGENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Scientific Hyclone | SH30028.02 | Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific Hyclone | SV3001403HI | Heat Inactivated; Sterile Environment |
| Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Sterile Environment |
| Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC | eBiosciences | 11-0112 | Sterile Environment |
| Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC | eBiosciences | 17-5931 | Sterile Environment |
| Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE | eBiosciences | 12-5931 | Sterile Environment |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Serial Dilution Sterile Environment |
| Cell Dissociation Sieve | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | Autoclave before use |
| 70-μm strainer | BD Biosciences | 352350 | Sterile Environment |
| 1X RBC Lysis Buffer | eBiosciences | 00-4333-57 | Warm to room temperature before use; Sterile Environment |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | Sterile Environment |
| 50ml conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Sterile Environment |
| 5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes | BD Biosciences | 352054 | Known as FACS tubes; Sterile Environment |
| 96-well V-bottom plates | Corning | 3897 | Sterile Environment |
| Trypan Blue | Cellgro | 25-900-CI | Sterile Environment |
| PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | Sterile Environment |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| AutoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| AutoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 |
References
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