Preparación de células mieloides supresoras derivadas (MDSC) de ingenuo y de páncreas ratones portadores del tumor mediante citometría de flujo magnético y automatizado de células activadas clasificación (AutoMACS)
Summary
Este es un método rápido y completo de inmunofenotipo mieloide derivados de células supresoras (MDSC) y enriquecedora Gr-1<sup> +</sup> Leucocitos de bazos de ratones. Este método utiliza la citometría de flujo y Celular AutoMACS clasificación para enriquecer viables Gr-1<sup> +</sup> Leucocitos antes de FACS clasificación de MDSC para su uso<em> En vivo</em> Y<em> In vitro</em> Ensayos.
Abstract
MDSC son una población heterogénea de los macrófagos, células dendríticas inmaduras y granulocitos que se acumulan en los órganos linfoides en condiciones patológicas, incluyendo la infección parasitaria, inflamación, estrés postraumático, la enfermedad de injerto contra huésped, la diabetes y el cáncer de 1-7. En ratones, MDSC expresa Mac-1 (CD11b) y Gr-1 (Ly6G y Ly6C) antígenos de superficie 7. Es importante señalar que MDSC se ha estudiado bien en varios portadores de tumores anfitriones donde son significativamente expandidas y reprimir anti-tumorales respuestas inmunes frente a las contrapartes no tratados previamente 7-10. Sin embargo, dependiendo de la condición patológica, hay diferentes subpoblaciones de MDSC con distintos mecanismos y objetivos de supresión 11,12. Por lo tanto, los métodos eficaces para aislar poblaciones viables MDSC son importantes para dilucidar sus diferentes mecanismos moleculares de supresión in vitro e in vivo.
Recientemente, el GHansah grupo ha informado de la expansión de MDSC en un modelo murino de cáncer de páncreas. El portador de tumor MDSC muestran una pérdida de la homeostasis y el aumento de la función supresora en comparación con el ingenuo MDSC 13. MDSC porcentajes son significativamente menores en los compartimentos linfoides de los ratones no tratados frente a un tumor-cojinete. Esta es una advertencia importante, que a menudo dificulta la precisión de estos análisis comparativos MDSC. Por lo tanto, enriquecer la Gr-1 + leucocitos de ratones no tratados previamente antes de la clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) mejora la pureza, la viabilidad y reduce significativamente el tiempo de ordenación. Sin embargo, el enriquecimiento de Gr-1 + leucocitos de ratones portadores de tumores es opcional ya que se encuentran en abundancia para la FACS rápidas de clasificación. Por lo tanto, en este protocolo, se describe un método muy eficaz de inmunofenotipo MDSC y enriquecer Gr-1 + leucocitos del bazo de los ratones no tratados previamente para ordenar MDSC de una manera oportuna. Ratones inmunocompetentes C57BL / 6 se inoculan con murino ce Panc02LLS por vía subcutánea, mientras que los ratones no tratados previamente recibirá 1XPBS. Aproximadamente 30 días después de la inoculación, el bazo se cosechan y se procesan en una sola célula suspensiones utilizando una celda de la disociación tamiz. A continuación se esplenocitos de glóbulos rojos (RBC) se lisaron y una alícuota de estos leucocitos se tiñen con un fluorocromo conjugado con anticuerpos contra la Mac-1 y Gr-1 a los porcentajes MDSC inmunofenotipo por citometría de flujo. En un experimento paralelo, los leucocitos de los ratones no tratados enteros están manchadas con fluorescentes conjugados con 1 gr de anticuerpos, se incubaron con el PE-MicroBeads y seleccionados de manera positiva con un sistema automatizado magnético de células activadas clasificación (autoMACS) Pro Separator. A continuación, una parte alícuota de Gr-1 + leucocitos se tiñen con Mac-1 anticuerpos para identificar el aumento en porcentajes MDSC utilizando citometría de flujo. Ahora bien, estos Gr1 + leucocitos enriquecidos están listos para la clasificación de MDSC FACS para ser utilizados en los análisis comparativos (ingenuo vs tumor cojinete-) in vivo e in vitro </em> ensayos.
Protocol
Discussion
Este es un método detallado para el procesamiento y immunophentyping poblaciones MDSC que es aplicable a diferentes tejidos linfoides de varios modelos animales. En particular, el enriquecimiento autoMACS puede ser utilizado para el aislamiento de varias poblaciones de leucocitos, incluyendo Gr-1 agotamiento de esplenocitos 4, la purificación de subconjuntos mieloides de esplenocitos y ganglios linfáticos 5, el aislamiento de los neutrófilos de médula ósea 14 y purificación de cé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos el flujo de USF Citometría Core Facility. Nos gustaría agradecer a la Dra. Denise Cooper para compartir recursos. También nos gustaría dar las gracias a Maya Cohen, Laura Pendleton y Latour de Diana por su ayuda en la creación y la filmación de este video. NN con el apoyo de la NSF FG-LSAMP puente hacia el desarrollo de recursos humanos de Becas de Doctorado # 0929435. Este trabajo fue financiado por la Sociedad Americana del Cáncer Institucional de Becas de Investigación # Centro del Cáncer 93-032-13/Moffitt otorgado a TG.
Materials
| REAGENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Scientific Hyclone | SH30028.02 | Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific Hyclone | SV3001403HI | Heat Inactivated; Sterile Environment |
| Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Sterile Environment |
| Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC | eBiosciences | 11-0112 | Sterile Environment |
| Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC | eBiosciences | 17-5931 | Sterile Environment |
| Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE | eBiosciences | 12-5931 | Sterile Environment |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Serial Dilution Sterile Environment |
| Cell Dissociation Sieve | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | Autoclave before use |
| 70-μm strainer | BD Biosciences | 352350 | Sterile Environment |
| 1X RBC Lysis Buffer | eBiosciences | 00-4333-57 | Warm to room temperature before use; Sterile Environment |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | Sterile Environment |
| 50ml conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Sterile Environment |
| 5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes | BD Biosciences | 352054 | Known as FACS tubes; Sterile Environment |
| 96-well V-bottom plates | Corning | 3897 | Sterile Environment |
| Trypan Blue | Cellgro | 25-900-CI | Sterile Environment |
| PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | Sterile Environment |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| AutoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| AutoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 |
References
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