Real-time Digital Imaging van leukocyt-endotheliale Interactie in ischemie-reperfusie schade (IRI) van de Rat cremasterspier
Summary
Digitale intravitale epifluorescentie microscopie van postcapillaire venulen in de cremasteric microcirculatie is een handige methode om inzicht te krijgen in leukocyten-endotheliale interactie<em> In vivo</em> In ischemie-reperfusie schade (IRI) van dwarsgestreept spierweefsel. Wij hier een gedetailleerd protocol om veilig uit te voeren de techniek en de toepassingen en beperkingen te bespreken.
Abstract
Ischemie-reperfusie schade (IRI) is betrokken bij een groot scala aan pathologische aandoeningen zoals cerebrale beroerte, hartinfarct, darmischemie en na de transplantatie en cardiovasculaire chirurgie. Een Reperfusie van eerder ischemisch weefsel, terwijl het van essentieel belang voor het voorkomen van onomkeerbare weefselbeschadiging, ontlokt veel ontsteking van het aangetaste weefsel. Naast de productie van zuurstofradicalen, activering van het complement systeem verhoogd microvasculaire permeabiliteit, de activering van leukocyten is een van de voornaamste actoren de pathologische cascade van inflammatoire weefselbeschadiging reperfusie. 2, 3 leukocytactivatiesyndroom een complex proces bestaat rollend, stevige hechting zielsverhuizing en wordt bemiddeld door een complex interactie tussen adhesiemoleculen reactie op chemoattractants zoals complementfactoren, chemokines, en bloedplaatjes-activerende factor 4.
<p class = "jove_content"> Terwijl rollen van leukocyten in postcapillaire venules voornamelijk gemedieerd wordt door de interactie van selectines 5 met hun liganden tegen, stevige hechting van leukocyten aan het endotheel is selectine gecontroleerde via binding aan intercellular adhesion molecules (ICAM) en vasculaire cellulaire adhesiemoleculen (VCAM). 6, 7Gouden standaard voor de in vivo waarnemingen van leukocyt-endotheliale interactie is de techniek van intravitaal microscopie eerst beschreven in 1968 8.
Hoewel de verschillende modellen van IRI (ischemie-reperfusie schade) zijn beschreven voor verschillende organen, 9-12 slechts enkele zijn geschikt voor directe visualisatie van leukocyt rekrutering in de microvasculaire bed op een hoog niveau van beeldkwaliteit. 8
Wij hier bevorderen digitale intravitaal epifluorescente microscopie van de postcapillaire venule de cremasteric microcirculatievan de rat 13 als een handige methode om leukocyten werving kwalitatief en kwantitatief te analyseren voor de IRI-onderzoek in dwarsgestreept spierweefsel en een gedetailleerde handleiding voor het vervullen van de techniek. We illustreren verder voorkomende valkuilen en geven nuttige tips, die in staat moet stellen de lezer echt te waarderen, en veilig uit te voeren van de methode.
In een stap voor stap protocol waarin we beschrijven hoe te beginnen met de ademhaling gecontroleerd anesthesie in voldoende controle om het dier stevig onder narcose te houden voor een langere periode van tijd. Daarna beschrijven we de cremasteric preparaat als een dunne vlakke plaat voor een uitstekende optische resolutie en een protocol voor leukocyten beeldvorming in IRI, dat goed is vastgelegd in onze laboratoria.
Protocol
Discussion
Leukocyten-endotheliale interactie, de productie van reactieve zuurstof soorten en activering van het complementsysteem zijn de belangrijkste kenmerken van de IRI-geïnduceerde weefsel disfunctie. 26 De microcirculatie van het aangetaste weefsel wordt beschouwd als de integrale site voor de ontstekingsreactie ontstaan. Naast de ex vivo experimenten zoals stroomkamer assays 27, 28 is het verplicht om gevestigde modellen van intravitale beeldvorming te verstrekken aan verdere beoordeling van…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de "Deutsche Forschungsgemeinschaft" om SU Eisenhardt (EI 866/1-1).
Materials
| Name of the equipment: | Company: | Catalogue No.: | Comments: |
| Forene 100% (V/V) | Abbot | B506 | API isoflurane |
| Terylene Suture | Serag Weissner | OC108000 | |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smiths Medical | 800/100/100 | 0.28 mm inner Diameter |
| 0,9% saline solution | Fresinus Kabi | 808771 | |
| Change-A-tip deluxe cautery kit | Bovie Medical | DEL1 | |
| Abbocath -T 14G | Venisystems | G713 – A01 | used as lens tube |
| Servo Ventilator 900C | Maquet | used as animal ventialtor | |
| Logical pressure transducer | Smiths Medical | MX1960 | |
| Sirecust 404 Monitor | Siemens | ||
| ABL 700 Benchtop Analyzer | Radiometer | for blood gas measurement | |
| Heating pad | Effenberger | 8319 | |
| Aluminum stage | Alfun | AW7022 | |
| Surgical microscope OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
| Microsurgical instruments lab set | S&T | 767 | |
| Biemer vessel clip | Diener | 64.562 | |
| Applying forceps | Diener | 64.568 | for Biemer vessel clip |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Vaseline white DAB | Winthrop | 2726853 | |
| Cover glasses | 32×32 mm | ||
| Intravital setup | |||
| Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | epifluorescence microscope |
| 470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fluorescence light source |
| Colibri 2 System | Carl Zeis | 423052 | |
| W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | water immersion objective |
| AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | high resolution digital camera |
| Axio vision LE software | Carl Zeis | 410130 | use for offline analysis |
References
- Cetin, C. Protective effect of fucoidin (a neutrophil rolling inhibitor) on ischemia reperfusion injury: experimental study in rat epigastric island flaps. Ann. Plast. Surg. 47, 540-546 (2001).
- Granger, D. N. Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am. J. Physiol. 255, H1269-H1275 (1988).
- Lazarus, B. The role of mast cells in ischaemia-reperfusion injury in murine skeletal muscle. J Pathol. 191, 443-448 (2000).
- van den Heuvel, M. G. Review: Ischaemia-reperfusion injury in flap surgery. J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 62, 721-726 (2009).
- Rosen, S. D. Cell surface lectins in the immune system. Semin. Immunol. 5, 237-247 (1993).
- van der Flier, A., Sonnenberg, A. Function and interactions of integrins. Cell Tissue Res. 305, 285-298 (2001).
- Panes, J., Perry, M., Granger, D. N. Leukocyte-endothelial cell adhesion: avenues for therapeutic intervention. Br. J. Pharmacol. 126, 537-550 (1999).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Sutton, T. A. Injury of the renal microvascular endothelium alters barrier function after ischemia. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 285, 191-198 (2003).
- Serracino-Inglott, F. Differential nitric oxide synthase expression during hepatic ischemia-reperfusion. Am. J. Surg. 185, 589-595 (2003).
- Eppinger, M. J. Mediators of ischemia-reperfusion injury of rat lung. Am J Pathol. 150, 1773-1784 (1997).
- Dumont, E. A. Real-time imaging of apoptotic cell-membrane changes at the single-cell level in the beating murine heart. Nat Med. 7, 1352-1355 (2001).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).
- Woeste, G. Octreotide attenuates impaired microcirculation in postischemic pancreatitis when administered before induction of ischemia. Transplantation. 86, 961-967 (2008).
- Schultz, J. E., Hsu, A. K., Gross, G. J. Morphine mimics the cardioprotective effect of ischemic preconditioning via a glibenclamide-sensitive mechanism in the rat heart. Circ. Res. 78, 1100-1104 (1996).
- Dobschuetz, E. v. o. n. Dynamic intravital fluorescence microscopy–a novel method for the assessment of microvascular permeability in acute pancreatitis. Microvasc Res. 67, 55-63 (2004).
- Vutskits, L. Adverse effects of methylene blue on the central nervous system. Anesthesiology. 108, 684-692 (2008).
- Takasu, A. Improved survival time with combined early blood transfusion and fluid administration in uncontrolled hemorrhagic shock in rats. J. Trauma. 8, 312-316 (2010).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, 34-41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation. J. Vis. Exp. (52), e2874 (2011).
- Kanwar, S., Hickey, M. J., Kubes, P. Postischemic inflammation: a role for mast cells in intestine but not in skeletal muscle. Am. J. Physiol. 275, 212-218 (1998).
- Leoni, G. Inflamed phenotype of the mesenteric microcirculation of melanocortin type 3 receptor-null mice after ischemia-reperfusion. FASEB J. 22, 4228-4238 (2008).
- Simoncini, T. Interaction of oestrogen receptor with the regulatory subunit of phosphatidylinositol-3-OH kinase. Nature. 407, 538-541 (2000).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ. Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Mori, N. Ischemia-reperfusion induced microvascular responses in LDL-receptor -/- mice. Am. J. Physiol. 276, H1647-H1654 (1999).
- Eisenhardt, S. U. Monitoring Molecular Changes Induced by Ischemia/Reperfusion in Human Free Muscle Flap Tissue Samples. Ann. Plast. Surg. , (2011).
- Eisenhardt, S. U. Generation of activation-specific human anti-{alpha}M{beta}2 single-chain antibodies as potential diagnostic tools and therapeutic agents. Blood. 109, 3521-3528 (2007).
- Eisenhardt, S. U. Dissociation of pentameric to monomeric C-reactive protein on activated platelets localizes inflammation to atherosclerotic plaques. Circ Res. 105, 128-137 (2009).
- Eisenhardt, S. U. C-reactive protein: how conformational changes influence inflammatory properties. Cell Cycle. 8, 3885-3892 (2009).
- Granger, D. N. . Physiology and pathophysiology of leukocyte adhesion. , 520 (1995).
- Baatz, H. Kinetics of white blood cell staining by intravascular administration of rhodamine 6G. Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 15, 85-91 (1995).
- Mempel, T. R. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes. J. Immunol. Methods. 239, 109-119 (2000).
