Real-time Digital Imaging von Leukozyten-Endothel-Interaktion in der Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) der Ratte Cremastermuskel
Summary
Digitale intravitalen Epifluoreszenzmikroskopie von postkapillären Venolen in der cremasterica Mikrozirkulation ist eine bequeme Methode, um Einblicke in die Leukozyten-Endothel Interaktion zu gewinnen<em> In-vivo-</em> In Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) der quergestreiften Muskulatur. Wir bieten hier ein ausführliches Protokoll, um sicher fahren zu können, die Technik und ihre Anwendungen zu diskutieren und Einschränkungen.
Abstract
Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) wurde in einer großen Reihe von pathologischen Zuständen, wie z. B. Schlaganfall, Herzinfarkt, intestinale Ischämie sowie nach der Transplantation und Herz-Kreislauf-Chirurgie. 1 Reperfusion des zuvor ischämischen Gewebe in Verbindung gebracht, während die wesentlich für die Vorbeugung irreversibler Gewebeverletzung, entlockt übermäßige Entzündung des betroffenen Gewebes. Angrenzend an die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, die Aktivierung des Komplementsystems und erhöhte mikrovaskuläre Permeabilität, die Aktivierung von Leukozyten eine der wichtigsten Akteure in der pathologische Kaskade von Gewebeschäden während der Reperfusion ist. 2, 3 ist Leukozytenaktivierung ein mehrstufiger Prozess, bestehend Walzen, feste Adhäsion und und wird durch eine komplexe Interaktion zwischen Adhäsionsmolekülen in Reaktion auf Lockstoffe wie Komplement, Chemokine oder der Plättchen-aktivierenden Faktor vermittelt werden. 4
<p class = "jove_content"> Während Leukozytenrollen in postkapillären Venolen wird überwiegend durch die Wechselwirkung der Selektine mit ihren fünf Zähler Liganden, feste Adhäsion von Leukozyten an das Endothel ist Selectin-gesteuerten über Bindung an intrazelluläre Adhäsionsmoleküle (ICAM) und vaskuläre zellvermittelten Adhäsionsmoleküle (VCAM). 6, 7Goldstandard für die in vivo-Beobachtung von Leukozyten-Endothelzellen-Wechselwirkung ist die Technik der Intravitalmikroskopie, erstmals 1968 beschrieben. 8
Obwohl verschiedene Modelle von IRI (Ischämie-Reperfusionsschaden) für verschiedene Organe beschrieben worden sind, sind nur wenige 9-12 geeignet für die direkte Visualisierung der Rekrutierung von Leukozyten in der mikrovaskulären Bett auf einem hohen Niveau der Bildqualität. 8
Wir fördern hier die digitale intravitalen Epifluoreszenzmikroskopie der postkapillären Venole in der Mikrozirkulation cremastericader Ratte 13 als eine bequeme Methode, um qualitativ und quantitativ analysieren Leukozytenrekrutierung für IRI-Forschung in der quergestreiften Muskulatur und eine detaillierte Anleitung zur Durchführung des Verfahren. Wir erläutern häufigsten Fallstricke und geben nützliche Tipps, die den Leser in den wirklich zu schätzen, und sicher ausführen sollte die Methode.
In einer Schritt für Schritt zeigen wir Protokoll, wie man mit der Atmung gesteuerten Anästhesie unter ausreichender Kontrolle zu halten, das Tier narkotisiert fest für längere Zeit loszulegen. Anschließend beschreiben wir das cremasterica Vorbereitung als dünne flache Platte für herausragende optische Auflösung und ein Protokoll für die Leukozyten-Bildgebung in der IRI, aber gut in unseren Labors etabliert.
Protocol
Discussion
Leukozyten-Endothel-Interaktion, sind die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und die Aktivierung des Komplementsystems die Hauptmerkmale der IRI-induzierten Gewebe Dysfunktion. 26. Die Mikrozirkulation des betroffenen Gewebes als integraler Standort für die entzündliche Entstehung betrachtet wird. Abgesehen von Ex-vivo-Experimente wie Flow Assays Kammer 27, 28 ist es zwingend notwendig, um gut etablierte Modelle der intravitalen Bildgebung weiter zu der in vivo-Relevanz …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des "Deutschen Forschungsgemeinschaft", um SU Eisenhardt (EI 866/1-1) unterstützt.
Materials
| Name of the equipment: | Company: | Catalogue No.: | Comments: |
| Forene 100% (V/V) | Abbot | B506 | API isoflurane |
| Terylene Suture | Serag Weissner | OC108000 | |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smiths Medical | 800/100/100 | 0.28 mm inner Diameter |
| 0,9% saline solution | Fresinus Kabi | 808771 | |
| Change-A-tip deluxe cautery kit | Bovie Medical | DEL1 | |
| Abbocath -T 14G | Venisystems | G713 – A01 | used as lens tube |
| Servo Ventilator 900C | Maquet | used as animal ventialtor | |
| Logical pressure transducer | Smiths Medical | MX1960 | |
| Sirecust 404 Monitor | Siemens | ||
| ABL 700 Benchtop Analyzer | Radiometer | for blood gas measurement | |
| Heating pad | Effenberger | 8319 | |
| Aluminum stage | Alfun | AW7022 | |
| Surgical microscope OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
| Microsurgical instruments lab set | S&T | 767 | |
| Biemer vessel clip | Diener | 64.562 | |
| Applying forceps | Diener | 64.568 | for Biemer vessel clip |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Vaseline white DAB | Winthrop | 2726853 | |
| Cover glasses | 32×32 mm | ||
| Intravital setup | |||
| Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | epifluorescence microscope |
| 470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fluorescence light source |
| Colibri 2 System | Carl Zeis | 423052 | |
| W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | water immersion objective |
| AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | high resolution digital camera |
| Axio vision LE software | Carl Zeis | 410130 | use for offline analysis |
References
- Cetin, C. Protective effect of fucoidin (a neutrophil rolling inhibitor) on ischemia reperfusion injury: experimental study in rat epigastric island flaps. Ann. Plast. Surg. 47, 540-546 (2001).
- Granger, D. N. Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am. J. Physiol. 255, H1269-H1275 (1988).
- Lazarus, B. The role of mast cells in ischaemia-reperfusion injury in murine skeletal muscle. J Pathol. 191, 443-448 (2000).
- van den Heuvel, M. G. Review: Ischaemia-reperfusion injury in flap surgery. J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 62, 721-726 (2009).
- Rosen, S. D. Cell surface lectins in the immune system. Semin. Immunol. 5, 237-247 (1993).
- van der Flier, A., Sonnenberg, A. Function and interactions of integrins. Cell Tissue Res. 305, 285-298 (2001).
- Panes, J., Perry, M., Granger, D. N. Leukocyte-endothelial cell adhesion: avenues for therapeutic intervention. Br. J. Pharmacol. 126, 537-550 (1999).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Sutton, T. A. Injury of the renal microvascular endothelium alters barrier function after ischemia. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 285, 191-198 (2003).
- Serracino-Inglott, F. Differential nitric oxide synthase expression during hepatic ischemia-reperfusion. Am. J. Surg. 185, 589-595 (2003).
- Eppinger, M. J. Mediators of ischemia-reperfusion injury of rat lung. Am J Pathol. 150, 1773-1784 (1997).
- Dumont, E. A. Real-time imaging of apoptotic cell-membrane changes at the single-cell level in the beating murine heart. Nat Med. 7, 1352-1355 (2001).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).
- Woeste, G. Octreotide attenuates impaired microcirculation in postischemic pancreatitis when administered before induction of ischemia. Transplantation. 86, 961-967 (2008).
- Schultz, J. E., Hsu, A. K., Gross, G. J. Morphine mimics the cardioprotective effect of ischemic preconditioning via a glibenclamide-sensitive mechanism in the rat heart. Circ. Res. 78, 1100-1104 (1996).
- Dobschuetz, E. v. o. n. Dynamic intravital fluorescence microscopy–a novel method for the assessment of microvascular permeability in acute pancreatitis. Microvasc Res. 67, 55-63 (2004).
- Vutskits, L. Adverse effects of methylene blue on the central nervous system. Anesthesiology. 108, 684-692 (2008).
- Takasu, A. Improved survival time with combined early blood transfusion and fluid administration in uncontrolled hemorrhagic shock in rats. J. Trauma. 8, 312-316 (2010).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, 34-41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation. J. Vis. Exp. (52), e2874 (2011).
- Kanwar, S., Hickey, M. J., Kubes, P. Postischemic inflammation: a role for mast cells in intestine but not in skeletal muscle. Am. J. Physiol. 275, 212-218 (1998).
- Leoni, G. Inflamed phenotype of the mesenteric microcirculation of melanocortin type 3 receptor-null mice after ischemia-reperfusion. FASEB J. 22, 4228-4238 (2008).
- Simoncini, T. Interaction of oestrogen receptor with the regulatory subunit of phosphatidylinositol-3-OH kinase. Nature. 407, 538-541 (2000).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ. Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Mori, N. Ischemia-reperfusion induced microvascular responses in LDL-receptor -/- mice. Am. J. Physiol. 276, H1647-H1654 (1999).
- Eisenhardt, S. U. Monitoring Molecular Changes Induced by Ischemia/Reperfusion in Human Free Muscle Flap Tissue Samples. Ann. Plast. Surg. , (2011).
- Eisenhardt, S. U. Generation of activation-specific human anti-{alpha}M{beta}2 single-chain antibodies as potential diagnostic tools and therapeutic agents. Blood. 109, 3521-3528 (2007).
- Eisenhardt, S. U. Dissociation of pentameric to monomeric C-reactive protein on activated platelets localizes inflammation to atherosclerotic plaques. Circ Res. 105, 128-137 (2009).
- Eisenhardt, S. U. C-reactive protein: how conformational changes influence inflammatory properties. Cell Cycle. 8, 3885-3892 (2009).
- Granger, D. N. . Physiology and pathophysiology of leukocyte adhesion. , 520 (1995).
- Baatz, H. Kinetics of white blood cell staining by intravascular administration of rhodamine 6G. Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 15, 85-91 (1995).
- Mempel, T. R. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes. J. Immunol. Methods. 239, 109-119 (2000).
