In tempo reale Imaging digitale di leucociti-endotelio in ischemia-riperfusione (IRI) del muscolo Cremaster Rat
Summary
Digital microscopia intravitale epifluorescenza delle venule postcapillari nella microcircolazione cremasterico è un metodo comodo per acquisire conoscenze in leucociti-endotelio<em> In vivo</em> In ischemia-riperfusione (IRI) del tessuto muscolare striato. Noi qui forniamo un protocollo dettagliato per eseguire in sicurezza la tecnica e discutere le sue applicazioni e limitazioni.
Abstract
L'ischemia-riperfusione (IRI) è stata implicata in una vasta gamma di condizioni patologiche come ictus cerebrale, infarto del miocardio, ischemia intestinale così come a seguito di trapianto e chirurgia cardiovascolare. 1 riperfusione di tessuto precedentemente ischemico, mentre essenziale per la prevenzione di irreversibile lesione dei tessuti, provoca infiammazione eccessiva del tessuto colpito. Adiacente alla produzione di specie reattive dell'ossigeno, l'attivazione del sistema del complemento e aumento della permeabilità microvascolare, l'attivazione di leucociti è uno degli attori principali nella cascata patologica del danno tissutale infiammatorio durante la riperfusione. 2, 3 attivazione dei leucociti è un processo multifasico che consiste di laminazione, adesione e la ferma ed è mediata da una complessa interazione tra molecole di adesione in risposta a fattori chemiotattici quali fattori del complemento, chemochine, o fattore attivante le piastrine 4.
<p class = "jove_content"> Mentre rolling leucociti in venule postcapillari è mediato principalmente dall'interazione di selectine 5 con loro ligandi contatore, ferma adesione dei leucociti all'endotelio selectina è controllato tramite legame a molecole di adesione intercellulare (ICAM) e vascolare cellulari molecole di adesione (VCAM) 6, 7.Gold standard per l'osservazione in vivo di leucociti-endotelio è la tecnica della microscopia intravitale, descritta per la prima nel 1968 8.
Benché vari modelli di IRI (ischemia-riperfusione) sono stati descritti per vari organi, 9-12 solo pochi sono adatti per la visualizzazione diretta del reclutamento di leucociti nel microcircolo a un alto livello di qualità dell'immagine. 8
Abbiamo qui promuovere la microscopia digitale intravitale epifluorescenza del venule postcapillari del microcircolo cremastericodel ratto 13 come un metodo conveniente per analizzare qualitativamente e quantitativamente il reclutamento dei leucociti per la ricerca IRI-nel tessuto muscolare striato e fornire un manuale dettagliato per realizzare la tecnica. Abbiamo inoltre illustrare le insidie più comuni e fornire consigli utili che dovrebbe consentire al lettore di apprezzare veramente, e sicuro di eseguire il metodo.
In un passo dal protocollo passo che raffigurano come iniziare con l'anestesia respirazione controllata sotto il controllo sufficiente a mantenere l'animale saldamente anestetizzato per lunghi periodi di tempo. Abbiamo poi descrivere la preparazione cremasterico come un sottile foglio appartamento in eccellente risoluzione ottica e fornisce un protocollo per l'imaging dei leucociti in IRI che è stato ben stabilito nei nostri laboratori.
Protocol
Discussion
Leucociti-endotelio, la produzione di specie reattive dell'ossigeno e l'attivazione del sistema del complemento sono le caratteristiche principali di IRI indotta disfunzione tessuto. 26 La microcircolazione del tessuto colpito è considerato come il sito integrale per l'insorgenza infiammatoria. A parte gli esperimenti ex vivo come test camera di flusso 27, 28, è obbligatorio fornire consolidati modelli di imaging intravitale di valutare ulteriormente la rilevanza in vivo….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una concessione del "Deutsche Forschungsgemeinschaft" a SU Eisenhardt (EI 866/1-1).
Materials
| Name of the equipment: | Company: | Catalogue No.: | Comments: |
| Forene 100% (V/V) | Abbot | B506 | API isoflurane |
| Terylene Suture | Serag Weissner | OC108000 | |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smiths Medical | 800/100/100 | 0.28 mm inner Diameter |
| 0,9% saline solution | Fresinus Kabi | 808771 | |
| Change-A-tip deluxe cautery kit | Bovie Medical | DEL1 | |
| Abbocath -T 14G | Venisystems | G713 – A01 | used as lens tube |
| Servo Ventilator 900C | Maquet | used as animal ventialtor | |
| Logical pressure transducer | Smiths Medical | MX1960 | |
| Sirecust 404 Monitor | Siemens | ||
| ABL 700 Benchtop Analyzer | Radiometer | for blood gas measurement | |
| Heating pad | Effenberger | 8319 | |
| Aluminum stage | Alfun | AW7022 | |
| Surgical microscope OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
| Microsurgical instruments lab set | S&T | 767 | |
| Biemer vessel clip | Diener | 64.562 | |
| Applying forceps | Diener | 64.568 | for Biemer vessel clip |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Vaseline white DAB | Winthrop | 2726853 | |
| Cover glasses | 32×32 mm | ||
| Intravital setup | |||
| Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | epifluorescence microscope |
| 470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fluorescence light source |
| Colibri 2 System | Carl Zeis | 423052 | |
| W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | water immersion objective |
| AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | high resolution digital camera |
| Axio vision LE software | Carl Zeis | 410130 | use for offline analysis |
References
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