Real-time Digital Imaging av leukocyttantigener-endotelial Interaksjon i iskemi-reperfusjon Injury (IRI) av Rat Cremaster Muscle
Summary
Digital intravital epifluorescence mikroskopi av postcapillary venules i cremasteric mikrosirkulasjonen er en praktisk metode for å få innsikt i leukocytt-endotelial interaksjon<em> In vivo</em> I iskemi-reperfusjon skade (IRI) av tverrstripet muskelvev. Vi her gi en detaljert protokoll trygt utføre teknikken og diskutere sine applikasjoner og begrensninger.
Abstract
Iskemi-reperfusjon skade (IRI) har vært innblandet i et stort utvalg av patologiske tilstander som hjerneslag, hjerteinfarkt, intestinal iskemi samt følge transplantasjon og kardiovaskulær kirurgi. En reperfusjon av tidligere iskemisk vev, mens avgjørende for forebygging av irreversibel vevsskade, utløser overdreven betennelse i vev. I tilknytning til produksjon av reaktive oksygenforbindelser, aktivering av komplementsystemet og økt mikrovaskulær permeabilitet, er aktivering av leukocytter en av de fremste aktørene i patologisk kaskade av inflammatoriske vevsskader under reperfusjon. 2, 3 leukocyttantigener aktivisering en multistep prosess bestående av 4 rullende, fast heft og sjelevandring og formidles av et komplekst samspill mellom adhesjonsmolekyler i respons til chemoattractants som komplement faktorer, chemokines eller blodplate-aktiverende faktor.
<p class = "jove_content"> Mens leukocytt rullende i postcapillary venules hovedsakelig skjer av et samspill av selectins 5 med sine telleren ligander, fast adhesjon av leukocytter til endotel er selektin-kontrollert via binding til intercellulær adhesjonsmolekyler (ICAM) og vaskulær cellulære adhesjonsmolekyler (VCAM). 6, 7Gullstandard for in vivo observasjon av leukocytt-endotelial interaksjon er teknikken for intravital mikroskopi, først beskrevet i 1968. 8
Selv om ulike modeller for IRI (iskemi-reperfusjon skade) har blitt beskrevet for ulike organer, 9-12 bare få er egnet for direkte visualisering av leukocytt rekruttering i mikrovaskulær sengen på et høyt nivå av bildekvalitet. 8
Vi her fremme digital intravital epifluorescence mikroskopi av postcapillary venule i cremasteric mikrosirkulasjonenav rotte 13 som en praktisk metode for å kvalitativt og kvantitativt analysere leukocytt rekruttering for IRI-forskning i tverrstripet muskelvev og gir en detaljert manual for å utføre teknikken. Vi ytterligere illustrere vanlige fallgruvene og gir nyttige tips som bør sette leseren virkelig setter pris på, og sikkert utføre metoden.
I en trinnvis protokollen skildre hvordan vi skal komme i gang med åndedrett kontrollert anestesi henhold tilstrekkelig overvåking for å holde dyret fast bedøvet for lengre perioder av gangen. Så beskriver cremasteric forberedelse som en tynn flat ark for fremragende optisk oppløsning og gi en protokoll for leukocytt bildebehandling i IRI som er godt etablert i våre laboratorier.
Protocol
Discussion
Leukocytt-endotelial interaksjon, produksjon av reaktive oksygenforbindelser og aktivering av komplementsystemet er de viktigste funksjonene i IRI-indusert vev dysfunksjon. 26 mikrosirkulasjonen i det berørte vevet er regnet som den integrerende nettstedet for inflammatorisk utbruddet. Bortsett fra ex vivo eksperimenter som flyt kammerkor analyser 27, 28 er det obligatorisk å gi veletablerte modeller av intravital bildebehandling for å ytterligere evaluere in vivo relevans. Sel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av et stipend av "Deutsche Forschungsgemeinschaft" til SU Eisenhardt (EI 866/1-1).
Materials
| Name of the equipment: | Company: | Catalogue No.: | Comments: |
| Forene 100% (V/V) | Abbot | B506 | API isoflurane |
| Terylene Suture | Serag Weissner | OC108000 | |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smiths Medical | 800/100/100 | 0.28 mm inner Diameter |
| 0,9% saline solution | Fresinus Kabi | 808771 | |
| Change-A-tip deluxe cautery kit | Bovie Medical | DEL1 | |
| Abbocath -T 14G | Venisystems | G713 – A01 | used as lens tube |
| Servo Ventilator 900C | Maquet | used as animal ventialtor | |
| Logical pressure transducer | Smiths Medical | MX1960 | |
| Sirecust 404 Monitor | Siemens | ||
| ABL 700 Benchtop Analyzer | Radiometer | for blood gas measurement | |
| Heating pad | Effenberger | 8319 | |
| Aluminum stage | Alfun | AW7022 | |
| Surgical microscope OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
| Microsurgical instruments lab set | S&T | 767 | |
| Biemer vessel clip | Diener | 64.562 | |
| Applying forceps | Diener | 64.568 | for Biemer vessel clip |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Vaseline white DAB | Winthrop | 2726853 | |
| Cover glasses | 32×32 mm | ||
| Intravital setup | |||
| Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | epifluorescence microscope |
| 470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fluorescence light source |
| Colibri 2 System | Carl Zeis | 423052 | |
| W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | water immersion objective |
| AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | high resolution digital camera |
| Axio vision LE software | Carl Zeis | 410130 | use for offline analysis |
References
- Cetin, C. Protective effect of fucoidin (a neutrophil rolling inhibitor) on ischemia reperfusion injury: experimental study in rat epigastric island flaps. Ann. Plast. Surg. 47, 540-546 (2001).
- Granger, D. N. Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am. J. Physiol. 255, H1269-H1275 (1988).
- Lazarus, B. The role of mast cells in ischaemia-reperfusion injury in murine skeletal muscle. J Pathol. 191, 443-448 (2000).
- van den Heuvel, M. G. Review: Ischaemia-reperfusion injury in flap surgery. J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 62, 721-726 (2009).
- Rosen, S. D. Cell surface lectins in the immune system. Semin. Immunol. 5, 237-247 (1993).
- van der Flier, A., Sonnenberg, A. Function and interactions of integrins. Cell Tissue Res. 305, 285-298 (2001).
- Panes, J., Perry, M., Granger, D. N. Leukocyte-endothelial cell adhesion: avenues for therapeutic intervention. Br. J. Pharmacol. 126, 537-550 (1999).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Sutton, T. A. Injury of the renal microvascular endothelium alters barrier function after ischemia. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 285, 191-198 (2003).
- Serracino-Inglott, F. Differential nitric oxide synthase expression during hepatic ischemia-reperfusion. Am. J. Surg. 185, 589-595 (2003).
- Eppinger, M. J. Mediators of ischemia-reperfusion injury of rat lung. Am J Pathol. 150, 1773-1784 (1997).
- Dumont, E. A. Real-time imaging of apoptotic cell-membrane changes at the single-cell level in the beating murine heart. Nat Med. 7, 1352-1355 (2001).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).
- Woeste, G. Octreotide attenuates impaired microcirculation in postischemic pancreatitis when administered before induction of ischemia. Transplantation. 86, 961-967 (2008).
- Schultz, J. E., Hsu, A. K., Gross, G. J. Morphine mimics the cardioprotective effect of ischemic preconditioning via a glibenclamide-sensitive mechanism in the rat heart. Circ. Res. 78, 1100-1104 (1996).
- Dobschuetz, E. v. o. n. Dynamic intravital fluorescence microscopy–a novel method for the assessment of microvascular permeability in acute pancreatitis. Microvasc Res. 67, 55-63 (2004).
- Vutskits, L. Adverse effects of methylene blue on the central nervous system. Anesthesiology. 108, 684-692 (2008).
- Takasu, A. Improved survival time with combined early blood transfusion and fluid administration in uncontrolled hemorrhagic shock in rats. J. Trauma. 8, 312-316 (2010).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, 34-41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation. J. Vis. Exp. (52), e2874 (2011).
- Kanwar, S., Hickey, M. J., Kubes, P. Postischemic inflammation: a role for mast cells in intestine but not in skeletal muscle. Am. J. Physiol. 275, 212-218 (1998).
- Leoni, G. Inflamed phenotype of the mesenteric microcirculation of melanocortin type 3 receptor-null mice after ischemia-reperfusion. FASEB J. 22, 4228-4238 (2008).
- Simoncini, T. Interaction of oestrogen receptor with the regulatory subunit of phosphatidylinositol-3-OH kinase. Nature. 407, 538-541 (2000).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ. Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Mori, N. Ischemia-reperfusion induced microvascular responses in LDL-receptor -/- mice. Am. J. Physiol. 276, H1647-H1654 (1999).
- Eisenhardt, S. U. Monitoring Molecular Changes Induced by Ischemia/Reperfusion in Human Free Muscle Flap Tissue Samples. Ann. Plast. Surg. , (2011).
- Eisenhardt, S. U. Generation of activation-specific human anti-{alpha}M{beta}2 single-chain antibodies as potential diagnostic tools and therapeutic agents. Blood. 109, 3521-3528 (2007).
- Eisenhardt, S. U. Dissociation of pentameric to monomeric C-reactive protein on activated platelets localizes inflammation to atherosclerotic plaques. Circ Res. 105, 128-137 (2009).
- Eisenhardt, S. U. C-reactive protein: how conformational changes influence inflammatory properties. Cell Cycle. 8, 3885-3892 (2009).
- Granger, D. N. . Physiology and pathophysiology of leukocyte adhesion. , 520 (1995).
- Baatz, H. Kinetics of white blood cell staining by intravascular administration of rhodamine 6G. Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 15, 85-91 (1995).
- Mempel, T. R. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes. J. Immunol. Methods. 239, 109-119 (2000).
