أخذ العينات الإنسان Peptidome اللعاب الأصلية باستخدام مسبار الترشيح الفائق المصاصة، مثل: تبسيط وتعزيز الكشف الببتيد لقياس الطيف الكتلي السريرية
Summary
تدرس أخذ عينات لعاب للتطبيق السريرية في المستقبل، ملفقة مصاصة مثل الترشيح الفائق (LLUF) مسبار لتناسب في تجويف الفم والإنسان. أظهر تحليل لعاب مباشر من عسر الهضم بواسطة الطيف الكتلي NanoLC-LTQ قدرة تحقيقات LLUF لإزالة البروتينات الكبيرة والبروتينات وفرة عالية، وجعل المنخفضة وفيرة الببتيدات أكثر للكشف.
Abstract
على الرغم من أن الإنسان قد كشفت بروتيوم اللعاب وpeptidome 1-2 حددت مجورلي هم من تريبسيني يساعد على هضم البروتينات لعاب. تحديد peptidome السكان الأصليين من لعاب الإنسان دون هضم مسبق مع الانزيمات الخارجية يصبح من الضروري، منذ الببتيد الأصلي في لعاب الإنسان توفير قيم المحتملة لتشخيص المرض، وتوقع تطور المرض، ومراقبة فعالية العلاج. الملائمة لأخذ العينات هو خطوة حاسمة لتعزيز التعرف على الإنسان peptidome لعاب السكان الأصليين. قد الأساليب التقليدية لأخذ عينات من لعاب الإنسان التي تنطوي على الطرد المركزي لإزالة الحطام 3-4 يكون أيضا وقتا طويلا لتكون قابلة للتطبيق للاستخدام السريري. وعلاوة على ذلك، قد إزالة الأنقاض عن طريق الطرد المركزي غير قادر على تنظيف معظم مسببات الأمراض المصابة وإزالة البروتينات وفرة العالية التي غالبا ما تعيق تحديد peptidome وفرة منخفضة.
البروتين الأساليب التقليدية أن الحزب الثوري المؤسسيالاستفادة من marily الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد (2-DE) المواد الهلامية في اقتران مع جل في الهضم قادرة على تحديد البروتينات لعاب كثير 5-6. ومع ذلك، فإن هذا النهج عموما ليست حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن الببتيدات وفرة منخفضة / البروتينات. السائلة اللوني قياس الطيف الكتلي (LC-MS) البروتيوميات القائم هو البديل الذي يمكن التعرف على البروتينات من دون فصل 2-DE قبل. على الرغم من أن هذا النهج يوفر أعلى حساسية، فإنه يحتاج عموما نموذج مسبق قبل التجزئة (7) وقبل الهضم مع التربسين، مما يجعل من الصعب للاستخدام السريري.
للالتفاف على عائق في مطياف الكتلة بسبب إعداد عينة، قمنا بتطوير تقنية تسمى الترشيح الفائق الشعرية (الجبهة المدنية المتحدة) 8-11 تحقيقات. أظهرت بيانات من مختبرنا أن تحقيقات حزب الجبهة المدنية المتحدة قادرة على التقاط البروتينات في الجسم الحي من مختلف microenvironments في الحيوانات بطريقة ديناميكية ومينيملي 8 –11. ليس هناك حاجة إلى الطرد المركزي منذ يتم إنشاء ضغط سلبي بواسطة حقنة ببساطة سحب أثناء جمع العينات. وقد حددت تحقيقات حزب الجبهة المدنية المتحدة جنبا إلى جنب مع LC-MS بنجاح البروتينات تريبسيني-هضمها 8-11. في هذه الدراسة، ورفع مستواها ونحن على تقنية الترشيح الفائق أخذ العينات عن طريق إنشاء مصاصة مثل الترشيح الفائق (LLUF) التحقيق التي يمكن أن تناسب بسهولة في التجويف الفموي الإنسان. وأظهر تحليل مباشر من قبل LC-MS بدون الهضم التربسين أن لعاب الإنسان محليا تحتوي على العديد من شظايا الببتيد المستمدة من البروتينات المختلفة. أخذ عينات لعاب مع تحقيقات LLUF تجنب الطرد المركزي ولكن على نحو فعال إزالة العديد من البروتينات وفرة كبيرة وعالية. نتائجنا الطيفي الشامل يتضح أن العديد من الببتيدات وفرة منخفضة أصبح اكتشافها بعد تصفية أكبر من البروتينات مع تحقيقات LLUF. وكان الكشف عن انخفاض الببتيد اللعاب وفرة من فصل مستقل عينة متعددة الخطوة مع اللوني. لتطبيق السريرية، وتحقيقات LLUF إدماجيحتمل د مع LC-MS تستخدم في المستقبل لمراقبة تطور المرض من اللعاب.
Protocol
Discussion
لقد وجدنا أن وجود العديد من شظايا الببتيد في لعاب الإنسان عسر الهضم. هذه الشظايا الببتيد هي مشتقات من أشكال مختلفة من البرولين الغنية والبروتينات، والأكتين، ألفا الأميليز، ألفا غلوبين 1، بيتا غلوبين، histain 1، الكيراتين 1، الميوسين 7، البوليمرية مستقبلات المناعي، satherin?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح (R01-AI067395-01، R21-R022754-01، و R21-01-I58002). نشكر جيم نيماير لقراءة نقدية للمخطوطة.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
References
- Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
- Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
- Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
- Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
- Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
- Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
- Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
- Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
- Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
- Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
- Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
- Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
- Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
- Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
- Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
- Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
- Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
- Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
- Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
- Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. 생화학. 44, 2885-2899 (2005).
- Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
- Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
- Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
- Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
- Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
- Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
- Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
- Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
- Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
- Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
- Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
- Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
- Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
- Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
- Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).
