רוק הדגימה האדם Peptidome ילידים באמצעות בדיקה Lollipop-Like Ultrafiltration: פשט ולשפר גילוי פפטיד של ספקטרומטריית מסה קלינית
Summary
בהתחשב רוק הדגימה עבור יישומים קליניים בעתיד, כמו סוכריה על מקל (LLUF) בדיקה ultrafiltration היה מפוברק להשתלב בחלל הפה האנושי. ניתוח ישיר של רוק לא מעוכל על ידי NanoLC-LTQ ספקטרומטריית מסה הפגינו את היכולת של בדיקות LLUF להסיר חלבונים גדולים וחלבונים שפע גבוהות, ולהפוך נמוך שפע לזיהוי פפטידים יותר.
Abstract
למרות רוק proteome האדם peptidome נחשפו 1-2 הם זוהו majorly מ tryptic מעכל חלבונים רוק. זיהוי peptidome המקומית של רוק אדם ללא עיכול מוקדם עם אנזימים אקסוגניים הופך הכרחי, שכן פפטידים מקומיים המצויים ברוק האדם לספק ערכים פוטנציאליים לאבחון מחלות, לחזות את התקדמות המחלה, ומעקב אחר היעילות הטיפולית. הדגימה המתאים הוא שלב קריטי להגברת ההזדהות של האדם peptidome הרוק המקומית. השיטות המסורתיות של דגימת רוק האנושי הכרוך צנטריפוגה כדי להסיר שאריות 3-4 אולי זמן רב מדי כדי להיות ישים לשימוש קליני. יתר על כן, סילוק פסולת על ידי צנטריפוגה ייתכן שלא תוכל לנקות את רוב פתוגנים נגועים ולהסיר את החלבונים שפע גבוהה כי לעתים קרובות לעכב את זיהוי peptidome שפע נמוכה.
גישות proteomic קונבנציונאלי כי פרימרילי לנצל דו מימדי ג'ל אלקטרופורזה (2-DE) ג 'ל ב הצמידה עם עיכול ג'ל מסוגלים לזהות חלבונים רוק רבים 5-6. עם זאת, גישה זו היא בדרך כלל לא רגיש מספיק כדי לזהות פפטידים שפע נמוך / חלבונים. כרומטוגרפיה נוזלית-Mass ספקטרומטריית (LC-MS) proteomics מבוססי מהווה חלופה שיכולה לזהות חלבונים ללא הפרדה 2-DE מוקדמת. אמנם גישה זו מספקת רגישות גבוהה יותר, זה בדרך כלל צריך מדגם לפני מראש חלוקה 7 ועיכול מראש עם טריפסין, אשר מקשה על שימוש קליני.
כדי לעקוף את מכשול של ספקטרומטריית מסה עקב הכנת המדגם, פיתחנו טכניקה המכונה ultrafiltration נימי (CUF) בדיקות 8-11. נתוני המעבדה שלנו הראה כי בדיקות CUF מסוגלים ללכוד חלבונים in vivo מ microenvironments שונים בבעלי חיים באופן דינמי פולשנית 8 –11. צנטריפוגה אין צורך מאז לחץ שלילי נוצר על ידי מזרק פשוט לסגת במהלך איסוף דגימה. בדיקות CUF בשילוב עם LC-MS זיהו בהצלחה חלבונים tryptic-מתעכל 8-11. במחקר זה, אנו לשדרג את טכניקת הדגימה ultrafiltration ידי יצירת דמוי סוכריה על מקל (LLUF) ultrafiltration בדיקה שיכולה בקלות להשתלב בחלל הפה האנושי. ניתוח ישירה של LC-MS ללא העיכול טריפסין הראה כי הרוק מכיל שברי אדם indigenously פפטידים רבים שמקורם חלבונים שונים. דגימת רוק עם בדיקות LLUF להימנע צנטריפוגה אבל להסיר בצורה יעילה הרבה חלבונים ושפע גדולים יותר גבוהה. תוצאות ספקטרומטריה שלנו לידי ביטוי, כי רבים פפטידים שפע נמוכות הפכה לגילוי לאחר סינון חלבונים גדולים יותר עם בדיקות LLUF. גילוי פפטידים רוק נמוכים ושפע היה בלתי תלוי ההפרדה מרובה צעד מדגם עם כרומטוגרפיה. עבור יישומים קליניים, בדיקות LLUF לשלבד עם LC-MS היא עשויה לשמש בעתיד כדי לעקוב אחר התקדמות המחלה מהרוק.
Protocol
Discussion
מצאנו כי שברי פפטידים רבים קיימים רוק מעוכלים האדם. אלו שברי פפטיד הם נגזרות של צורות שונות של פרולין עשירים בחלבונים, אקטין, אלפא עמילאז, אלפא 1 גלובין, בטא גלובין, histain 1, קרטין 1, mucin 7, הקולטן אימונוגלובולינים פולימריות, satherin, S100A9. יכול להיות שיש גורמים רבים התורמים ליי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 ו-R21 I58002-01). אנו מודים ג נימאייר על קריאה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
References
- Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
- Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
- Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
- Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
- Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
- Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
- Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
- Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
- Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
- Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
- Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
- Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
- Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
- Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
- Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
- Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
- Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
- Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
- Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
- Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. 생화학. 44, 2885-2899 (2005).
- Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
- Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
- Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
- Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
- Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
- Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
- Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
- Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
- Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
- Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
- Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
- Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
- Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
- Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
- Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).
