Behandling av primær hjernesvulst Tissue for Stem Cell Assays og Flow Sortere

Summary

Identifisering av hjernesvulst initiere celler (BTICs), sjeldne celler i en heterogen tumor besitter stamcelleforskningen egenskaper, gir ny innsikt i menneskelige hjerne svulst patogenesen. Vi har raffinert spesifikke kultur forhold til å berike for BTICs, og vi rutinemessig bruk flowcytometri å berike disse populasjonene. Selvfornyelse analyser og karakterutskrift analyse av enkelt celle RT-PCR kan senere bli utført på disse isolerte celler.

Abstract

Hjernesvulster er vanligvis består av morfologisk forskjellige celler som uttrykker en rekke nevrale avstamning markører. Bare en forholdsvis liten brøkdel av celler i tumoren med stilk celleegenskaper betegnes hjernesvulst initierende celler (BTICs), ha en evne til å differensiere langs flere linjer, selv-fornyelse og initiere svulster in vivo. Vi søkte dyrkningsbetingelser opprinnelig brukt for normale nevrale stamceller (NSCs) til en rekke menneskelige hjernesvulster og funnet ut at denne kulturen metoden spesielt velger for stilk-lignende populasjoner. Serumfritt medium (NSC) muliggjør opprettholdelse av en udifferensiert stamcelle tilstand, og tillegg av bFGF og EGF tillater spredning av multi-potente, selv-fornyelse, og utvidbare tumorspheres.

For ytterligere å karakterisere hver svulsten BTIC befolkningen, vurderer vi celleoverflaten markører ved flowcytometri. Vi kan også sortere bestander av interesse for mer spesifikke characterizasjon. Selvfornyelse analysene er utført på enkelt BTICs sortert i 96 brønners plater; dannelsen av tumorspheres etter inkubering ved 37 ° C indikerer nærværet av en stilk eller stamceller. Flere celle tall av en bestemt populasjon kan også sorteres i forskjellige brønner for begrensende fortynning analyse, å analysere selvfornyelse kapasitet. Vi kan også studere differensial genuttrykk i en bestemt celle befolkning ved hjelp av enkelt celle RT-PCR.

Følgende protokoller beskrive våre prosedyrer for dissosiasjon og dyrkning av primære humane prøver å berike for BTIC populasjoner samt Dissosiasjonen av tumorspheres. Det finnes også protokoller for farging for flowcytometri analyse eller sortering, selvfornyelse analyser, og enkelt celle RT-PCR.

Introduction

Hjernesvulster er blant de mest aggressive og heterogene kreft kjent hos mennesker. Selv om deres tidligere oppdagelse og diagnose er tilrettelagt av moderne nevro-imaging teknologi, vi mangler fortsatt helbredende terapi for mange hjernesvulster, spesielt for diffuse, invasive eller de ligger dypt i hjernen.

Hjernesvulster representerer den ledende årsaken til kreft dødelighet hos barn på grunn av deres svært aggressiv og ofte uhelbredelig natur. Glioblastoma (GBM), den vanligste primær hjernesvulst hos voksne, er en av de mest aggressive humane cancertyper fryktet for sine jevnt dødelig prognose ^1. Denne svært ondartet astrocytic tumor (WHO grad 4) oppstår vanligvis i de cerebrale halvkuler av voksne, og kan også forekomme i små barn og spedbarn. Veksten er rask og infiltrerende og diagnostiske patologiske funksjoner inkluderer kjernekraft pleomorphism, mikrovaskulær spredning, og nekrose ^2,3. For adults med nylig diagnostisert GBM, strekker median overlevelse sjelden utover 12 måneder ^1, med generelt dårlige svar på alle terapeutiske modaliteter. Vi merket oss at det er mange funksjonelle og genetiske likheter som deles av somatiske stamceller og kreftceller, og at de molekylære mekanismer som regulerer normal utvikling av hjernen er ofte feilregulert i kreft. Ved anvendelsen av stamceller biologi paradigmer til studiet av hjernesvulster, vi var de første forskerne som prospektivt identifisere og rense en undergruppe av celler fra menneskelige GBMS som utstilt stamcelleforskningen egenskaper spredning, selvfornyelse og differensiering in vitro ⁴ og i vivo ^5. Vi søkte dyrkningsbetingelser og analyser opprinnelig brukt for å karakterisere normale nevrale stamceller (NSCs) in vitro ^6,7 til flere barn og voksne hjernesvulster, og beriket for disse stilk-lignende celler ved celle sortering for den nevrale stamceller overflate markør CD133 ^{8 ,}9. Den CD133 + hjernesvulst brøkdel inneholdt celler som hadde en mye høyere frekvens av startfasen enn CD133-fraksjonen i NOD-SCID mus hjerner ^5,10. Dette formelt etablert som bare en sjelden undergruppe av hjernesvulst celler med stamcelle egenskaper er tumor-initiere, tjene dem navnet "hjernesvulst initiere celler" eller "BTICs". Romanen identifisering av BTICs gir ny innsikt i menneskelige hjerne tumorigenesis, noe som gir sterk støtte til kreft stamceller hypotese ^10-13 som grunnlag for mange solide svulster, og etablerer en ny mobil mål for mer effektive kreft behandlinger ^14-20. Terapi som fokuserer på å drepe mesteparten av svulsten kan gå glipp av den sjeldne stilk-lignende fraksjon, slik at svulsten å fortsette å vokse. Terapi som fokuserer på å drepe kreft stamcelle kan gi bedre behandling og prognose for pasienter med hjernesvulster.

For å studere BTIC populasjoner, har vi videreutviklet vår culture protokoller spesifikt velger for celle populasjoner innenfor menneskelige hjernesvulster som besitter stamcelleforskningen egenskaper. Serumfritt, nevrale stamcelle (NSC) mediet tillater for vedlikehold av en udifferensiert stamcelle tilstand, og tillegg av grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF), epidermal vekstfaktor (EGF), og leukemi inhibitorisk faktor (LIF) tillater spredning av multi-potent, selv fornye og utvidbare menneskelige tumorspheres. Her beskriver vi de metoder som er involvert i behandlingen av primære hjernesvulster og dyrking dem i NSC medium å berike for BTIC populasjoner. Vi har kalt vårt eksperimentell modell system "BTIC polikliniske pasienter" for å understreke det faktum at disse cellene er bare minimalt dyrket i henhold stammen celle forhold til å velge for stamcelleforskningen populasjoner. Påfølgende immunolabelling av BTIC populasjoner for viktige stamceller markører som CD133 og CD15 og flowcytometri analyse er også beskrevet. Vi diskuterer den begrensende fortynning analyse,som hjelpemidler i å studere selvfornyelse potensialet BTICs. Til slutt undersøker vi genekspresjonsanalyse av disse sjeldne celler ved å sortere enkeltceller på AmpliGrid lysbilder og utføre enkelt celle RT-PCR. Disse teknikkene er også gjeldende for andre hjernesvulster som medulloblastoma, ependymoma og pediatriske hjernesvulst.

Protocol

1. Culture of Brain Tumor Tissue Tilsett 200 pl opptint Liberase (Roche Applied Science) til 15 ml kunstig CSF (aCSF-se tabell 1) og fyll i 37 ° C vannbad. Liberase TM er en blanding av proteolytiske enzymer som brukes å dissosiere primære vevsprøver samt dyrkede tumorspheres. I motsetning til Trypsin-EDTA, bevarer Liberase metoden overflateantigen CD133. For en vevsprøve av ca 0,5 cm 3, bruker vi 200 ul Liberase. Hvis vevet er mindre, bruker vi 100 ul. Bring ammoniu…

Discussion

Kreften stamcelle hypotesen ^10, basert på arbeid i leukemi ^21, brystkreft ¹¹ og hjernekreft ^4,5, antyder at bare en relativt liten del av cellene i svulsten, betegnet kreft stamceller, besitter en evne til omfattende sprer og selv fornye. De fleste av kreftceller mister evnen til å spre seg og selv fornye som de differensiere i cellene som blir den fenotypiske signatur av svulsten. Finne de viktigste cellene i hjernen svulst befolkningen som er i stand til å opprettholde sv…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
1:1 DMEM:F12	Invitrogen	11320-082
N2 supplement	Invitrogen	17502-048
1M HEPES	Wisent	330-050-EL
Glucose	Invitrogen	15023-021
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich	A9165-25g
Neural survival factor -1 (NSF-1)	Lonza Clonetics	CC-4323
Epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Invitrogen	PHG0261
Leukemia inhibitory factor (LIF)	Millipore	LIF1010
Antibiotic/mycotic	Wisent	450-115-EL
Liberase TM	Roche	05 401 119 001
Ammonium chloride solution	Stem Cell Technologies	07850