Verarbeitung von primären Hirntumoren Tissue für Stem Cell Assays und Flow Sortierung
Summary
Die Identifizierung von Gehirntumor initiierende Zellen (BTICs), die seltenen Zellen innerhalb einer heterogenen Tumor besitzt Stammzell-Eigenschaften, liefert neue Einblicke in das menschliche Gehirn Tumor Pathogenese. Wir haben spezifische Kulturbedingungen verfeinert für BTICs bereichern, und wir routinemäßig Durchflusszytometrie weiter bereichern diese Populationen. Selbsterneuerung Assays und Transkript Analyse durch einzelne Zelle RT-PCR kann anschließend auf diesen isolierten Zellen durchgeführt werden.
Abstract
Hirntumoren sind typischerweise aus morphologisch unterschiedlichen Zellen, die eine Vielzahl von neuronalen Marker exprimieren Linie besteht. Nur ein relativ kleiner Teil der Zellen im Tumor mit Stammzelleigenschaften, genannt Gehirntumor initiierende Zellen (BTICs), besitzen die Fähigkeit, entlang mehrerer Abstammungslinien unterscheiden, selbst zu erneuern, und initiieren Tumoren in vivo. Wir wendeten Kulturbedingungen ursprünglich für normalen neuralen Stammzellen (NSC) an einer Vielzahl von menschlichen Gehirntumoren verwendet und festgestellt, dass diese Kultur spezifisch Verfahren wählt für stielartigen Populationen. Serum-freiem Medium (NSC) ermöglicht die Aufrechterhaltung eines undifferenzierten Stammzellen Zustand, und die Zugabe von bFGF und EGF ermöglicht die Verbreitung von Multi-potent, sich selbst erneuernden und erweiterbaren tumorspheres.
Zur weiteren Charakterisierung der einzelnen Tumors BTIC Bevölkerung, werten wir Zelloberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie. Wir können auch sortieren Bevölkerung von Interesse für die besonderen characterization. Selbsterneuerung Assays sind auf einzelnen BTICs in 96 Well-Platten sortiert durchgeführt, die Bildung von tumorspheres nach Inkubation bei 37 ° C zeigt das Vorhandensein von einem Stamm oder Vorläuferzelle. Mehrere Zellzahlen von einer bestimmten Population können auch in verschiedenen Brunnen für Grenzverdünnung Analyse sortiert werden, um sich selbst zu erneuern Fähigkeit zu analysieren. Wir können auch studieren differentiellen Genexpression innerhalb einer bestimmten Zellpopulation mit einzelnen Zelle RT-PCR.
Die folgenden Protokolle beschreiben unser Verfahren zur Dissoziation und Kultivieren von primären humanen Proben zum Nachweis BTIC Populationen sowie die Dissoziation von tumorspheres anzureichern. Ebenfalls eingeschlossen sind Protokolle für die Färbung für Durchflusszytometrie Analyse oder Sortierung, Selbsterneuerung Assays und einzelne Zelle RT-PCR.
Introduction
Hirntumoren gehören zu den aggressiven und heterogene Krebsarten beim Menschen bekannt. Obwohl ihre frühere Erkennung und Diagnose von modernen bildgebenden Technik erleichtert worden, wir noch fehlt kurative Therapien für vielen Hirntumoren, insbesondere für diffuse, invasive Einsen oder diesen sich tief im Gehirn.
Hirntumoren stellen die Hauptursache der Krebssterblichkeit im Kindesalter aufgrund ihrer sehr aggressiven und oft unheilbaren Natur. Glioblastom (GBM), der häufigsten primären Hirntumoren bei Erwachsenen, ist einer der aggressivsten Krebserkrankungen des Menschen, für seine gleichmäßig tödlichen Prognose 1 gefürchtet. Diese hoch-malignen astrozytären Tumor (WHO Grad 4) tritt meist in den zerebralen Hemisphären von Erwachsenen, und kann auch bei kleinen Kindern und Säuglingen auftreten. Sein Wachstum ist schnell und infiltrative und diagnostische pathologischen Merkmale sind Kernpolymorphie, mikrovaskuläre Proliferation und Nekrosen 2,3. Für adults mit neu diagnostiziertem GBM, mediane Überlebenszeit nur selten erstreckt sich über 12 Monate 1, mit allgemein schlechte Antworten auf alle therapeutischen Modalitäten. Wir haben festgestellt, dass es viele funktionale und genetische Ähnlichkeiten durch somatische Stammzellen und Krebszellen geteilt, und dass die molekularen Signalwege, die normale Entwicklung des Gehirns reguliert werden häufig in der Krebstherapie fehlreguliert. Bei der Anwendung der Stammzellbiologie Paradigmen zur Untersuchung von Hirntumoren, wir waren die ersten Forscher, die prospektiv zu identifizieren und zu reinigen eine Subpopulation von Zellen aus menschlichen GBMs, die Stammzell-Eigenschaften der Proliferation, Selbsterneuerung ausgestellt, und die Differenzierung in vitro 4 und in vivo 5. Wir wendeten Kulturbedingungen und Assays ursprünglich zur normalen neuralen Stammzellen (NSC) in vitro 6,7 charakterisieren, um mehrere Kinder-und Erwachsenen Hirntumoren und angereichert für diesen Stamm-ähnlichen Zellen durch Zellsortierung für das neuronale Vorläuferzellen Zelloberflächenmarker CD133 8 ,9. Die CD133 + Gehirntumor Fraktion enthaltenen Zellen, die eine viel höhere Frequenz als das Tumorinitiation CD133-Fraktion in NOD-SCID Mäusehirnen 5,10 hatte. Dieses formal festgestellt, dass nur eine seltene Untergruppe von Hirntumoren Zellen mit Stammzell-Eigenschaften Tumor-Initiierung, verdienen sie den Namen "Gehirntumor initiierende Zellen" oder "BTICs" sind. Der Roman Identifizierung BTICs gibt neue Einblicke in das menschliche Gehirn Tumorgenese, geben starke Unterstützung für die Krebsstammzellen Hypothese 10-13 als Grundlage für die vielen soliden Tumoren und stellt eine neuartige zelluläre Ziel für eine effektivere Krebstherapien 14-20. Therapien, die sich auf das Töten der Großteil des Tumors die seltene stielartigen Bruchteil verpassen kann, so dass der Tumor weiter wachsen. Therapien, die sich auf das Töten der Krebsstammzellen eine bessere Behandlung und Prognose für Patienten mit Hirntumoren vorsehen.
Um BTIC Populationen zu untersuchen, haben wir unsere cultu verfeinertre Protokolle speziell für Zellpopulationen innerhalb der menschlichen Hirntumoren, die Stammzell-Eigenschaften besitzen wählen. Serumfreiem, neurale Stammzellen (NSC) Medium ermöglicht die Wartung von einer undifferenzierten Stammzellen Zustand, und die Zugabe von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), und Leukämie inhibierenden Faktor (LIF) ermöglicht die Verbreitung von Multi-potent, sich selbst erneuernden und erweiterbaren menschlichen tumorspheres. Hier beschreiben wir die Methoden bei der Verarbeitung von primären Hirntumoren und Kultivierung sie in NSC Medium für BTIC Bevölkerung bereichern beteiligt. Wir nannten unsere experimentellen Modellsystem "BTIC Patienten Isolate", die Tatsache, dass diese Zellen nur minimal unter Stammzellen kultiviert betonen Zelle Bedingungen für Stammzellpopulationen auszuwählen. Nachfolgende Immunmarkierung von BTIC Populationen für Schlüssel Stammzellmarkern wie CD133 und CD15 und Durchflusszytometrie-Analyse wird ebenfalls beschrieben. Dann besprechen wir die Grenzverdünnung Analyseder Beihilfen bei der Untersuchung der Selbsterneuerung Potenzial BTICs. Schließlich untersuchen wir die Genexpressionsanalyse dieser seltenen Zellen durch Sortierung einzelnen Zellen auf AmpliGrid Dias und Durchführung einzelne Zelle RT-PCR. Diese Techniken sind auch anwendbar auf andere Hirntumore wie Medulloblastom, Ependymom und pädiatrische Gliomen.
Protocol
Discussion
Die Krebsstammzelle Hypothese 10, auf der Arbeit bei Leukämie 21 basierend, Brustkrebs 11 und Hirnkrebs 4,5, legt nahe, dass nur ein relativ kleiner Teil der Zellen im Tumor, bezeichnet Krebsstammzellen, eine Fähigkeit, ausgiebig proliferieren und selbst besitzen erneuern. Die meisten der Tumorzellen die Fähigkeit verlieren, sich zu vermehren und selbst zu erneuern, als sie in Zellen, die die phänotypische Signatur des Tumors zu differenzieren. Den Schlüssel Zellen im Geh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Ontario Institute of Cancer Research (OICR), die Terry Fox Stiftung und der American Association of Neurological Surgeons finanziert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 1:1 DMEM:F12 | Invitrogen | 11320-082 |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 |
| 1M HEPES | Wisent | 330-050-EL |
| Glucose | Invitrogen | 15023-021 |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165-25g |
| Neural survival factor -1 (NSF-1) | Lonza Clonetics | CC-4323 |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0261 |
| Leukemia inhibitory factor (LIF) | Millipore | LIF1010 |
| Antibiotic/mycotic | Wisent | 450-115-EL |
| Liberase TM | Roche | 05 401 119 001 |
| Ammonium chloride solution | Stem Cell Technologies | 07850 |
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