Lavorazione dei tessuti primaria tumore al cervello per saggi su cellule staminali e flusso di Ordinamento
Summary
L'identificazione delle cellule tumorali del cervello avvio (BTICs), le cellule rare all'interno di una proprietà eterogenee di cellule staminali tumorali che possiedono, fornisce nuove intuizioni patogenesi umana tumore al cervello. Abbiamo affinato specifiche condizioni di coltura per arricchire per BTICs, e noi abitualmente uso citometria a flusso per arricchire ulteriormente queste popolazioni. Autorinnovamento saggi e analisi trascritto di singola cellula RT-PCR può successivamente essere eseguita su queste cellule isolate.
Abstract
Tumori cerebrali sono in genere costituito da cellule morfologicamente diverse che esprimono una varietà di marcatori neurali lignaggio. Solo una frazione relativamente piccola di cellule nel tumore con proprietà staminali, chiamate cellule tumorali cerebrali avvio (BTICs), possiedono una capacità di differenziare lungo linee multiple, auto-rinnovano, e avviare tumori in vivo. Abbiamo applicato condizioni di coltura in origine usati per le normali cellule staminali neurali (NSC) a una varietà di tumori del cervello umano e ha scoperto che questo metodo cultura seleziona appositamente per stelo tipo popolazioni. Terreno privo di siero (NSC) consente il mantenimento di uno stato indifferenziato di cellule staminali, e l'aggiunta di EGF e bFGF permette la proliferazione di multi-potente, auto-rinnovano, e tumorspheres espandibili.
Per caratterizzare ulteriormente popolazione BTIC ciascun tumore, valutiamo marcatori di superficie cellulare mediante citometria a flusso. Possiamo anche ordinare le popolazioni di interesse per caratteriz più specifichezione. Autorinnovamento saggi vengono eseguiti su singole BTICs filtrate in piastre a 96 pozzetti, la formazione di tumorspheres dopo l'incubazione a 37 ° C indica la presenza di uno stelo o di cellule staminali. Il numero di cellule multiple di una particolare popolazione può anche essere ordinati in diversi pozzetti per limitare l'analisi di diluizione, per analizzare la capacità di auto-rinnovamento. Possiamo anche studiare l'espressione genica differenziale all'interno di una popolazione cellulare particolare utilizzando singola cella RT-PCR.
I protocolli seguenti descrivono le procedure per la dissociazione e la coltura di campioni umani primari per arricchire per popolazioni BTIC, così come la dissociazione di tumorspheres. Sono inclusi anche i protocolli per la colorazione per citometria a flusso o smistamento, self-renewal saggi, e singola cellula RT-PCR.
Introduction
I tumori cerebrali sono tra i tumori più aggressivi ed eterogenei conosciute negli esseri umani. Anche se la loro diagnosi precoce e la diagnosi sono state facilitate dalla moderna neuro-tecnologia di imaging, ci manca ancora terapie curative per i tumori cerebrali, in particolare per quelli invasivi diffuse, o quelle situate in profondità nel cervello.
I tumori cerebrali rappresentano la principale causa di mortalità per cancro nei bambini a causa della loro natura altamente aggressiva e spesso incurabile. Glioblastoma (GBM), il più comune tumore cerebrale primario negli adulti, è uno dei tumori più aggressivi umani, temeva per la sua prognosi uniformemente fatale 1. Questo tumore altamente maligno astrocitari (di grado 4) di solito si verifica negli emisferi cerebrali degli adulti, e può verificarsi anche nei bambini piccoli e neonati. La sua crescita è rapida e infiltrante, e diagnostici caratteristiche patologiche includono pleomorfismo nucleare, la proliferazione microvascolare e necrosi 2,3. Per adults con GBM di recente diagnosi, la sopravvivenza mediana va raramente oltre 12 mesi 1, con le risposte in genere poveri a tutte le modalità terapeutiche. Abbiamo notato che ci sono molte somiglianze funzionali e genetici condivisi da cellule staminali somatiche e cellule tumorali, e che le vie molecolari che regolano lo sviluppo normale del cervello sono spesso alterata nelle cancro. Nell'applicare staminali paradigmi biologia cellulare allo studio dei tumori cerebrali, siamo stati i primi ricercatori a identificare in modo prospettico e purificare una sottopopolazione di cellule di GBM umani che esibivano le proprietà delle cellule staminali di proliferazione, self-renewal e la differenziazione in vitro 4 e in vivo 5. Abbiamo applicato condizioni di coltura e saggi originariamente utilizzate per caratterizzare normali cellule staminali neurali (NSC) in vitro 6,7 a più tumori cerebrali pediatrici e adulti, e arricchito di questi-come le cellule staminali da cellule di ordinamento per la neurale marcatore di superficie delle cellule progenitrici CD133 8 ,9. Il CD133 + frazione di tumore al cervello conteneva cellule che hanno una frequenza molto più elevata di apertura del tumore rispetto al-CD133 frazione in NOD-SCID 5,10 topo cervello. Questo formalmente stabilito che solo un sottoinsieme rara di cellule cerebrali tumorali con caratteristiche di cellule staminali sono tumore avvio, guadagnandosi il nome di "tumore al cervello iniziare cellule" o "BTICs". L'identificazione romanzo di BTICs fornisce nuove intuizioni tumorigenesi cervello umano, dando un forte sostegno per l'ipotesi delle cellule staminali del cancro 10-13 come base per molti tumori solidi, e stabilisce un nuovo bersaglio cellulare per ulteriori terapie antitumorali efficaci 14-20. Terapie che si concentrano a uccidere la maggior parte del tumore può perdere la rara simil-staminali frazione, permettendo al tumore di continuare a crescere. Terapie che si concentrano a uccidere le cellule staminali tumorali possono fornire un migliore trattamento e la prognosi per i pazienti con tumori cerebrali.
Al fine di studiare le popolazioni BTIC, abbiamo affinato la nostra culture protocolli per selezionare specificamente per popolazioni di cellule all'interno di tumori cerebrali umani che possiedono proprietà delle cellule staminali. Privo di siero, cellule staminali neurali (NSC) medie consente il mantenimento di uno stato indifferenziato di cellule staminali, e l'aggiunta del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF), fattore di crescita epidermico (EGF) e fattore inibitorio di leucemia (LIF) consente la proliferazione di multi-potenti, auto-rigenerante, e espandibili tumorspheres umani. Qui, descriviamo i metodi coinvolti nel trattamento dei tumori cerebrali primari e coltura in mezzo NSC per arricchire per le popolazioni BTIC. Abbiamo chiamato il nostro sistema modello sperimentale "isolati di pazienti BTIC" per sottolineare il fatto che queste cellule sono solo in minima parte coltivate in staminali condizioni delle celle alla selezione di popolazioni di cellule staminali. immunolabelling successiva delle popolazioni BTIC di indicatori chiave di cellule staminali, quali CD133 e CD15 e citometria analisi dei flussi è anche descritto. Discutiamo poi l'analisi di diluizione limitante,che aiuta nello studio del self-renewal potenziale di BTICs. Infine, abbiamo esplorare l'analisi di espressione genica delle cellule rare ordinando singole cellule su vetrini AmpliGrid ed eseguendo singola cella RT-PCR. Queste tecniche sono applicabili anche ad altri tumori cerebrali come il medulloblastoma, ependimoma e gliomi pediatrici.
Protocol
Discussion
Il gambo ipotesi cancro cella 10, sulla base di lavoro 21 nella leucemia, cancro al seno e cancro al cervello 11 4,5, suggerisce che solo una frazione relativamente piccola di cellule nel tumore, chiamate cellule staminali tumorali, possiedono la capacità di proliferare e ampiamente auto -rinnovo. La maggior parte delle cellule tumorali perdono la capacità di proliferare e auto-rinnovano come differenziarsi in cellule che diventano la firma fenotipica del tumore. Trovare le cellule chi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dall'Istituto Ontario di ricerca sul cancro (OICR), la Terry Fox Foundation e l'American Association of Neurological Surgeons.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 1:1 DMEM:F12 | Invitrogen | 11320-082 |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 |
| 1M HEPES | Wisent | 330-050-EL |
| Glucose | Invitrogen | 15023-021 |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165-25g |
| Neural survival factor -1 (NSF-1) | Lonza Clonetics | CC-4323 |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0261 |
| Leukemia inhibitory factor (LIF) | Millipore | LIF1010 |
| Antibiotic/mycotic | Wisent | 450-115-EL |
| Liberase TM | Roche | 05 401 119 001 |
| Ammonium chloride solution | Stem Cell Technologies | 07850 |
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