Traitement des tissus de tumeur cérébrale primaire pour les essais sur les cellules souches et les flux de tri
Summary
L'identification des cellules tumorales du cerveau d'amorçage (BTICs), les cellules rares, dans un tumorales hétérogènes possédant des propriétés de cellules souches, offre de nouvelles perspectives sur la pathogénie des tumeurs cérébrales humaines. Nous avons amélioré les conditions de culture spécifiques pour enrichir BTICs, et nous avons l'habitude d'utiliser la cytométrie en flux pour enrichir davantage ces populations. D'auto-renouvellement des tests et de l'analyse par transcription seule cellule RT-PCR peut ensuite être effectuée sur ces cellules isolées.
Abstract
Les tumeurs cérébrales sont typiquement constitués de cellules morphologiquement différents qui expriment une variété de marqueurs de lignage neural. Seule une fraction relativement faible de cellules dans la tumeur avec des propriétés de cellules souches, appelées cellules tumorales du cerveau d'amorçage (BTICs), possèdent une capacité à différencier selon plusieurs lignées, auto-renouvellement, et d'initier des tumeurs in vivo. Nous avons appliqué les conditions de culture utilisés à l'origine pour les normales des cellules souches neurales (NSC) à une variété de tumeurs cérébrales humaines et a constaté que cette méthode de culture sélectionne spécifiquement pour les souches de type populations. Un milieu sans sérum (NSC) permet le maintien d'un état de cellules souches non différenciées, et l'addition de bFGF et EGF permet la prolifération des multi-puissant, auto-renouvellement, et tumorspheres expansibles.
Pour caractériser davantage la population BTIC chaque tumeur, nous évaluons marqueurs de surface cellulaire par cytométrie en flux. Nous pouvons également trier les populations d'intérêt pour characteriz plus spécifiquestion. L'auto-renouvellement des essais sont réalisés sur BTICs simples triés dans des plaques à 96 puits, la formation d'tumorspheres après incubation à 37 ° C indique la présence d'une tige ou d'une cellule progénitrice. Le nombre de cellules multiples d'une population donnée peut également être triées dans différents puits pour limiter l'analyse de dilution, d'analyser la capacité d'auto-renouvellement. Nous pouvons également étudier expression différentielle des gènes dans une population cellulaire particulière en utilisant seule cellule RT-PCR.
Les protocoles suivants décrivent les procédures pour la dissociation et de culture primaire d'échantillons humains pour enrichir des populations BTIC, ainsi que la dissociation de tumorspheres. Sont également inclus les protocoles de coloration pour l'analyse de cytométrie de flux ou tri, l'auto-renouvellement des essais, et seule cellule RT-PCR.
Introduction
Les tumeurs cérébrales sont parmi les cancers les plus agressifs et hétérogènes connus chez l'homme. Bien que leur détection précoce et le diagnostic ont été facilitées par la neuro-imagerie moderne de la technologie, nous manquons encore de traitement curatif pour les tumeurs cérébrales nombreuses, en particulier pour diffuses, celles envahissantes ou celles situées profondément dans le cerveau.
Les tumeurs cérébrales représentent la première cause de mortalité par cancer chez les enfants en raison de leur caractère très agressif et souvent incurable. Le glioblastome (GBM), la tumeur cérébrale primaire la plus fréquente chez l'adulte, est l'un des cancers les plus agressifs de l'homme, craint pour son pronostic toujours fatale 1. Cette tumeur très maligne astrocytaire (OMS grade 4) se produit généralement dans les hémisphères cérébraux des adultes, et peut également se produire chez les jeunes enfants et les nourrissons. Sa croissance est rapide et infiltrantes et de diagnostic des caractéristiques pathologiques comprennent pléomorphisme nucléaire, la prolifération microvasculaire et une nécrose 2,3. Pour adults avec glioblastome nouvellement diagnostiqué, la médiane de survie dépasse rarement 12 mois 1, avec des réponses généralement pauvres à toutes les modalités thérapeutiques. Nous avons remarqué qu'il ya beaucoup de similitudes fonctionnelles et génétiques partagées par les cellules souches somatiques et les cellules cancéreuses, et que les voies moléculaires qui régulent le développement normal du cerveau sont souvent dérégulée dans le cancer. En appliquant les paradigmes en biologie des cellules souches à l'étude des tumeurs du cerveau, nous étions les premiers chercheurs à identifier de manière prospective et purifier une sous-population de cellules de GBM de l'homme qui présentaient les propriétés des cellules souches de la prolifération, l'autorenouvellement et la différenciation in vitro 4 et dans vivo 5. Nous avons appliqué les conditions de culture et les dosages utilisés à l'origine pour caractériser les cellules souches neurales normales (NSC) in vitro à de multiples 6,7 tumeurs cérébrales pédiatriques et adultes, et enrichi par ces cellules souches comme par tri cellulaire pour le marqueur de surface des cellules progénitrices neurales CD133 8 ,9. Le CD133 + fraction tumeur au cerveau contient des cellules qui ont une fréquence beaucoup plus élevée de l'initiation tumorale que le CD133-fraction dans les cerveaux de souris NOD-SCID 5,10. Cette formellement établi que seul un sous-ensemble rare de cellules tumorales du cerveau avec des propriétés de cellules souches sont des tumeurs initier, de les gagner le nom de «tumeur au cerveau cellules initiatrices» ou «BTICs". L'identification roman de BTICs offre de nouvelles perspectives sur la tumorigenèse cerveau humain, accordant son soutien résolu à l'hypothèse des cellules souches cancéreuses 10-13 comme base pour de nombreuses tumeurs solides, et établit une nouvelle cible cellulaire pour des thérapies plus efficaces contre le cancer 14-20. Thérapies qui mettent l'accent sur les tuant la majeure partie de la tumeur risquent de rater le rare tige-comme fraction, permettant à la tumeur de continuer à croître. Thérapies qui mettent l'accent sur la destruction des cellules souches du cancer peut offrir un meilleur traitement et le pronostic des patients atteints de tumeurs cérébrales.
Afin d'étudier les populations BTIC, nous avons affiné notre culture protocoles spécifiquement sélectionnées pour les populations de cellules au sein des tumeurs cérébrales humaines qui possèdent des propriétés de cellules souches. Sans sérum, les cellules souches neurales (NSC) permet moyen pour le maintien d'un état de cellules souches non différenciées, et l'addition de facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF), le facteur de croissance épidermique (EGF), le facteur inhibiteur de leucémie et (LIF) permet de la prolifération des multi-puissant, d'auto-renouvellement et extensibles tumorspheres de l'homme. Ici, nous décrivons les méthodes impliquées dans le traitement des tumeurs cérébrales primaires et leur culture dans un milieu de NSC pour enrichir les populations BTIC. Nous avons appelé notre modèle expérimental "isolats de patients BTIC» pour souligner le fait que ces cellules sont très peu cultivées dans des souches conditions de la cellule pour sélectionner des populations de cellules souches. immunomarquage ultérieur des populations BTIC pour les principaux marqueurs de cellules souches telles que CD133 et CD15 et l'analyse par cytométrie en flux est également décrit. Nous discutons ensuite l'analyse de dilution limitante,qui aide à étudier le potentiel d'auto-renouvellement de BTICs. Enfin, nous explorons l'analyse de l'expression des gènes de ces cellules rares en triant les cellules simples sur des lames AmpliGrid et l'exécution seule cellule RT-PCR. Ces techniques sont également applicables aux autres tumeurs cérébrales telles que le médulloblastome, épendymome et les gliomes pédiatriques.
Protocol
Discussion
L'hypothèse de cellules souches du cancer 10, basé sur le travail dans la leucémie 21, le cancer du sein 11 et 4,5 le cancer du cerveau, suggère que seule une fraction relativement faible de cellules dans la tumeur, appelées cellules souches cancéreuses, possèdent une capacité à proliférer et largement auto renouveler. La plupart des cellules tumorales perdent leur capacité à proliférer et à se renouveler car ils se différencient en cellules qui deviennent l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par l'Institut ontarien de recherche sur le cancer (IORC), la Fondation Terry Fox et l'American Association of Neurological Surgeons.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 1:1 DMEM:F12 | Invitrogen | 11320-082 |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 |
| 1M HEPES | Wisent | 330-050-EL |
| Glucose | Invitrogen | 15023-021 |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165-25g |
| Neural survival factor -1 (NSF-1) | Lonza Clonetics | CC-4323 |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0261 |
| Leukemia inhibitory factor (LIF) | Millipore | LIF1010 |
| Antibiotic/mycotic | Wisent | 450-115-EL |
| Liberase TM | Roche | 05 401 119 001 |
| Ammonium chloride solution | Stem Cell Technologies | 07850 |
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