Costante pressione controllata metodo di estrusione per la preparazione del Nano di dimensioni vescicole lipidiche

Summary

Questo protocollo descrive un metodo di estrusione per la preparazione di vescicole lipidiche di sub-micron dimensioni con un alto grado di omogeneità. Questo metodo utilizza un sistema a pressione controllata con velocità controllate flusso di azoto per la preparazione di liposomi. La preparazione lipidica^1,2, Estrusione liposoma, e caratterizzazione formato saranno qui presentata.

Abstract

I liposomi sono vescicole preparati artificialmente costituiti da fosfolipidi naturali e sintetici che sono ampiamente utilizzati come una membrana cellulare che imita piattaforma per studiare proteina-proteina e proteina-lipide interazioni ^3, drug delivery monitoraggio ^4,5, e ⁴ incapsulamento. I fosfolipidi creano naturalmente doppi strati lipidici curvi, distinguendosi da una micella. ⁶ I liposomi sono tradizionalmente classificate per dimensione e numero di bistrati, cioè vescicole grandi unilamellari (Luvs), piccole vescicole unilamellari (SUV) e vescicole multilamellari (MLV) ^7. In particolare, la preparazione di liposomi omogenee di varie dimensioni è importante per lo studio curvatura membrana che svolge un ruolo essenziale nella segnalazione cellulare, endo-e esocitosi, fusione della membrana, e il traffico proteina ^8. Diversi gruppi analizzare come le proteine ​​vengono utilizzati per modulare i processi che coinvolgono curvatura della membrana e quindi preparare liposomi di diametro <100 – 400nm a studiare il loro comportamento su funzioni cellulari ^3. Altri si concentrano sulla liposomi-incapsulamento della droga, studiando liposomi come veicoli per trasporto e la distribuzione di un farmaco di interesse ^9. Incapsulamento farmaco può essere ottenuto come riportato durante la formazione dei liposomi ^9. Il nostro passo di estrusione non dovrebbe pregiudicare il farmaco incapsulato per due motivi, vale a dire (1) incapsulamento farmaco deve essere raggiunto prima di questo passo e (2) liposomi dovrebbero conservare la loro stabilità naturale biofisico, reggere saldamente il farmaco nel nucleo acquoso. Questi obiettivi ulteriori ricerche indicano la necessità di un metodo ottimizzato per progettare stabili sub-micron vescicole lipidiche.

Tuttavia, le attuali tecnologie preparazione liposomica sonicazione ^(10, congelamento-scongelamento ^e-10, sedimentazione) non consentono la preparazione di liposomi con superficie altamente curva (ossia diametro <100 nm) con efficienza elevata consistenza e ^10,5, che limita la biofisico studi di un emergicampo di rilevamento ng curvatura membrana. Qui, presentiamo un metodo efficace per una varietà di preparazione di liposomi biologicamente rilevanti.

Estrusione manuale con siringhe a tenuta di gas e membrane in policarbonato ^10,5 è una pratica comune, ma l'eterogeneità si osserva spesso quando si usa dimensioni dei pori <100 nm a causa a causa della variabilità della pressione manuale applicata. Abbiamo impiegato una pressione costante controllata apparato di estrusione per preparare liposomi sintetici cui diametri compresi tra 30 e 400 nm. Light scattering dinamico (DLS) ^10, microscopia elettronica ¹¹ e tracciamento analisi delle nanoparticelle (NTA) ¹² sono stati usati per quantificare le dimensioni del liposoma come descritto nel nostro protocollo, con polistirene commerciale (PS) perle utilizzate come standard di calibrazione. Una correlazione quasi lineare è stata osservata tra le dimensioni dei pori e dei lavoratori liposomi determinati sperimentalmente, che indica l'alta fedeltà della nostra pressione controllata preparazione liposomiale incontratoHod. Inoltre, abbiamo dimostrato che questo vescicola metodo di preparazione lipidica è generalmente applicabile, indipendente di varie dimensioni liposomi. Infine, abbiamo anche dimostrato in uno studio corso di tempo che questi liposomi preparati sono rimasti stabili per un massimo di 16 ore. Un rappresentante di dimensioni nano protocollo di preparazione liposomiale è illustrato di seguito.

Protocol

1. Preparazione liposomica Recuperare un flaconcino da 20 ml in vetro con una rivestita di teflon cap. Pulire la vetreria e le siringhe con cloroformio prima dell'uso per evitare contaminazioni. Trasferire 100 ul di cloroformio distillata al flacone di vetro con un 250 microlitri a tenuta d'aria siringa di vetro. Aggiungere 30 microlitri di metanolo distillata al flacone stesso bicchiere con un 100 pl a tenuta d'aria siringa di vetro. Per preparare un mM 2 7…

Discussion

Utilizzando il Avestin Liposofast LF-50 Estrusore, abbiamo dimostrato come piccole dimensioni, liposomi sintetici vengono preparati attraverso una pressione sistema controllato. È importante notare che formano vescicole multilamellari spontaneamente dopo idratazione liposoma, che può portare alla produzione di nanoparticelle più piccole. Queste piccole vescicole multilamellari inevitabilmente fluire attraverso maggiore è la dimensione dei pori di membrana di policarbonato, causando eterogeneità in soluzioni di vesc…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Chloroform	Sigma-Aldrich	02432-25ML	95% stabilizers
High Grade Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L
Liposofast LF-50 Extruder	Avestin, Inc.
Phospholipids	Avanti Polar Lipids
Polycarbonate Pores	Avestin, Inc.		25 mm diameter
Drain discs PE	Avestin, Inc.	230600	25 mm diameter