ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法
Summary
このプロトコルは、同質性の高いサブミクロンサイズの脂質小胞を調製するための押出法を説明します。このメソッドは、リポソーム調製のための制御された窒素の流量と圧力制御システムを使用しています。脂質の準備<sup> 1,2</sup>、リポソーム押し出し、サイズの特性は、本明細書に表示されます。
Abstract
リポソームは人工的に広く、モニター薬物送達4,5、およびカプセル化4タンパク質-タンパク質及びタンパク質-脂質相互作用の3を勉強するためのプラットフォームを模倣して細胞膜として使用されている天然および合成のリン脂質からなる小胞を用意されています。リン脂質は当然ミセルから自分自身を区別し、湾曲した脂質二重層を作成します。6リポソームは、伝統的に二重層のサイズと数、すなわち大規模単層小胞（LUVs）、小型単層小胞（SUV）やマルチラメラベシクル（MLV）は7に分類されています。特に、さまざまなサイズの均一なリポソームの調製は、細胞シグナリング、エンドおよびエキソサイトーシス、膜融合、およびタンパク質輸送8に重要な役割を果たしている膜の曲率を研究するために重要である。 400 – いくつかのグループは、タンパク質は、膜の曲率を伴うため、径のリポソームを調製プロセスが<100を変調するために使用されるかを分析細胞の機能3の行動を研究するためにnmである。その他の関心の9薬剤を運ぶ提供する媒体としてリポソームを勉強して、リポソーム薬物カプセル化に焦点を当てています。リポソーム形成9の間に報告された薬剤のカプセル化を達成することができます。私たちの押出工程はふたつの理由からカプセル化された薬に影響を及ぼしてはならない、すなわち、（1）薬物のカプセル化は、このステップの前に達成されるべきである、（2）リポソームは安全に水性コアに薬剤を運ぶ、その自然の生物物理学的安定性を保持する必要があります。これらの研究目標は、さらに安定したサブミクロンの脂質小胞を設計するために最適化された方法の必要性を示唆している。
それにもかかわらず、現在のリポソーム調製技術（超音波10、凍結と融解10、沈殿）が非常に湾曲した表面とリポソームの調製を許可していない（すなわち、直径<100 nm）で高い一貫性と効率10,5と、生物物理学を制限するemergiの研究膜曲率センサーのngのフィールド。ここで、我々は生物学的に関連したリポソームの様々な堅牢な調製法を提示する。
ガスタイトシリンジとポリカーボネート膜10,5を使用して手動で押し出しが一般的ですが、適用されたマニュアルの圧力の変動に起因するために孔径<100 nmを使用する場合は、異質性がしばしば観察される。我々は、直径30〜400nmの間の範囲の合成リポソームを調製するための一定の圧力制御の押出装置を採用しています。動的光散乱（DLS）10、電子顕微鏡11とナノ粒子トラッキング解析（NTA）12は、我々のプロトコルで説明したように校正標準として使用される市販のポリスチレン（PS）ビーズで、リポソームのサイズを定量化するために使用された。近くに線形相関が満たされている私たちの圧力制御リポソーム製剤の高忠実度を示す、自営業細孔の大きさと実験的に決定したリポソームの間に観察されたHOD。さらに、私たちは、この脂質ベシクルの調製法は、様々なリポソームサイズの独立した、一般的に適用可能であることが示されている。最後に、我々はまた、これらの準備されたリポソームは、最大16時間にわたって安定したことを時間経過の研究で実証されている。代表的なナノサイズのリポソーム調製プロトコルは以下に示されています。
Protocol
Discussion
Avestin Liposofast LF-50押出機を用いて、我々は小型、合成リポソームは圧力制御システムを介して作成されている方法を紹介しました。多層小胞が小さいナノ粒子の製造につながる可能性がありリポソーム水和、以下の自発的に形成することに注意することが重要です。これらの小さな多層小胞は、必然的に大規模なフィルター細孔によって生成されたユニラメラベシクル溶液中で不均一性を引…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、コラボレーティブ·イノベーション·アワードハワードヒューズ医学研究所（HHMI）によってサポートされていました。 LAMは、保健研修助成金（T32 GM008759）とNIHルースL.キルシュシュタインプレドクトラルフェロー（CA165349-01）のシグナリングと生体調節研究所によってサポートされていました。我々は彼らの非常に貴重なコメントのために教授のマイケル·ストーウェル（CUボールダー）、教授ダグラス·リース教授ロブ·フィリップス（カリフォルニア工科大学）に感謝したいと思います。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 02432-25ML | 95% stabilizers |
| High Grade Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | |
| Liposofast LF-50 Extruder | Avestin, Inc. | ||
| Phospholipids | Avanti Polar Lipids | ||
| Polycarbonate Pores | Avestin, Inc. | 25 mm diameter | |
| Drain discs PE | Avestin, Inc. | 230600 | 25 mm diameter |
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