Konstant tryck kontrollerad Extrusion metod för framställning av Nano-storlek lipidvesiklar
Summary
Detta protokoll beskriver en extruderingsmetod för framställning lipidvesiklar av sub-mikron storlek med en hög grad av homogenitet. Denna metod använder en tryckstyrd system med kontrollerad takt kväveflöde i liposomberedningen. Lipiden beredning<sup> 1,2</sup> Kommer liposomen extrudering och storlek karakterisering presenteras här.
Abstract
Liposomer är artificiellt framställda vesikler bestående av naturliga och syntetiska fosfolipider som ofta används som ett cellmembran härma plattform för att studera protein-protein och protein-lipid interaktioner 3 monitor drug delivery 4,5, och inkapsling 4. Fosfolipider skapar naturligt böjda lipidbiskikt, skilja sig från en micell. 6 Liposomer traditionellt klassificeras efter storlek och antal biskikt, dvs stora unilamellära vesiklar (LUV), små unilamellära vesiklar (SUV) och multilamellära vesiklar (MLV) 7. I synnerhet är framställningen av homogena liposomer av olika storlekar viktigt för att studera membran krökning som spelar en viktig roll i cell signalering, endo-och exocytos, membran fusion, och protein människohandel 8. Flera grupper analysera hur proteiner används för att modulera processer som involverar membranet krökning och därmed förbereda liposomer med en diameter <100 – 400NM att studera deras beteende på cellfunktioner 3. Andra är inriktade på liposomer-drug inkapsling, studerar liposomer som fordon att bära och leverera ett läkemedel av intresse 9. Drug inkapsling kan uppnås som redovisas under liposombildning 9. Vår extrudering steg bör inte påverka det inkapslade läkemedlet av två skäl, bör alltså (1) läkemedel inkapsling uppnås före detta steg och (2) liposomer bör behålla sin naturliga biofysiska stabilitet, säkert bär läkemedlet i den vattenhaltiga kärnan. Dessa forskningsmål föreslår vidare behovet av en optimerad metod för att utforma stabila submikrona lipidvesiklar.
Icke desto mindre tillåter de nuvarande liposomberedningen teknik (sonikering 10, frys-och-tö 10, sedimentering) inte framställning av liposomer med höggradigt krökt yta (dvs. diameter <100 nm) med hög konsistens och effektivitet 10,5, vilket begränsar den biofysiska studier av en emerging inom avkänning membran krökning. Häri presenterar vi en stark framställningsmetod för en mängd olika biologiskt relevanta liposomer.
Manuell extrudering med gastäta sprutor och polykarbonat membran 10,5 är en vanlig metod, men heterogenitet ofta observeras vid användning av porstorlekar <100 nm på grund av på grund av variationer av manuell applicerat tryck. Vi använde en konstant tryck-styrda strängsprutningsapparat för att framställa syntetiska liposomer vars diametrar varierar mellan 30 och 400 nm. Dynamisk ljusspridning (DLS) 10, elektronmikroskopi 11 och nanopartiklar spårning analys (NTA) 12 användes för att kvantifiera de liposomstorlekar som beskrivs i vår protokollet, med kommersiell polystyren (PS) pärlor används som en kalibreringsstandard. En nästan linjär korrelation observerades mellan de använda porstorlekar och de experimentellt bestämda liposomer, vilket indikerar hög fidelitet av vår tryckstyrd liposomberedningen uppfylldaHod. Vidare har vi visat att denna lipidvesikel framställningsmetod är allmänt tillämpbar oberoende av olika liposomstorlekar. Slutligen har vi visat också i en tidsförloppsstudie att dessa framställda liposomerna var stabila i upp till 16 timmar. Ett representativt nano-storlek liposomberedningen protokollet visas nedan.
Protocol
Discussion
Använda Avestin Liposofast LF-50 Extruder visade vi hur liten storlek, är syntetiska liposomer genom en tryck-styrt system. Det är viktigt att notera att multilamellära vesiklar bildas spontant efter liposom hydratisering, vilket kan leda till produktion av mindre nanopartiklar. Dessa små multilamellära vesiklar kommer oundvikligen att strömma genom den större polykarbonatmembranet porstorlek, vilket orsakar ojämnhet i lösningar av unilamellära vesiklar framställda genom en stor filtrets porstorlek. Därför…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Collaborative Innovation Award. LAM stöddes av signal-och Cellular förordning National Institute of Health utbildningsstipendium (T32 GM008759) och NIH Ruth L. Kirschstein doktorander Fellow (CA165349-01). Vi vill tacka professor Michael Stowell (CU Boulder), Prof. Douglas Rees och professor Rob Phillips (Caltech) för sina ovärderliga kommentarer.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 02432-25ML | 95% stabilizers |
| High Grade Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | |
| Liposofast LF-50 Extruder | Avestin, Inc. | ||
| Phospholipids | Avanti Polar Lipids | ||
| Polycarbonate Pores | Avestin, Inc. | 25 mm diameter | |
| Drain discs PE | Avestin, Inc. | 230600 | 25 mm diameter |
References
- Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).
- Smith, S. A., Morrissey, J. H. Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes. J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).
- Hui, E., Johnson, C. P., Yao, J., Dunning, F. M., Chapman, E. R. Synaptotagmin-mediated bending of the target membrane is a critical step in Ca(2+)-regulated fusion. Cell. 138, 709-721 (2009).
- Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. J. Immunol. Methods. 132, 25-35 (1990).
- Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. Extrusion technique to generate liposomes of defined size. Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).
- Gruner, S. M., Cullis, P. R., Hope, M. J., Tilcock, C. P. Lipid polymorphism: the molecular basis of nonbilayer phases. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 211-238 (1985).
- Guven, A., Ortiz, M., Constanti, M., O’Sullivan, C. K. Rapid and efficient method for the size separation of homogeneous fluorescein-encapsulating liposomes. J. Liposome. Res. 19, 148-154 (2009).
- Zimmerberg, J., Kozlov, M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 9-19 (2006).
- Chonn, A., Cullis, P. R. Recent advances in liposomal drug-delivery systems. Curr. Opin. Biotechnol. 6, 698-708 (1995).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochim. Biophys. Acta. 858, 161-168 (1986).
- Matsuoka, K., Schekman, R. The use of liposomes to study COPII- and COPI-coated vesicle formation and membrane protein sorting. Methods. 20, 417-428 (2001).
- Dragovic, R. A., Gardiner, C., Brooks, A. S., Tannetta, D. S., Ferguson, D., Hole, P., Carr, B., Redman, C., Harris, A. L., Dobson, P. J., Harrison, P., Sargent, I. L. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. , (2011).
- Hunter, D. G., Frisken, B. J. Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles. Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).
