On-Chip-Endothelial Entzündliche Phänotypisierung
Summary
Mikrofluidische Strömungskammern durch Photolithographie geätzt und hergestellt von PDMS werden angewendet, um die funktionellen Ergebnisse mit den EG-Dysfunktion und Entzündung zu untersuchen. In einem repräsentativen Experiment, die Fähigkeit der Differential Scherbeanspruchung zu modulieren die Zelladhäsion an Monozyten Cytokin aktiviert EG Monoschichten nachgewiesen wird.
Abstract
Atherogenese wird durch Stoffwechselstörungen, die zu einem erhöhten Zustand des systemischen Entzündung was zu einer endothelialen Dysfunktion beitragen potenziert. Allerdings sind frühe funktionelle Veränderungen im Endothel, dass die individuelle Höhe des Risikos bedeuten nicht direkt zu klinisch therapeutische Strategie Guide helfen zu beurteilen. Darüber hinaus trägt die Regulierung der Entzündung, die durch lokale Hämodynamik zu dem nicht-zufällige räumliche Verteilung der Atherosklerose, aber die Mechanismen sind schwer in vivo zu beschreiben. Wir beschreiben ein Lab-on-a-Chip-basierten Ansatz zur quantitativen Assay metabolischen Störung der entzündlichen Ereignisse in humanen Endothelzellen (EC) und Monozyten unter genauen Strömungsverhältnisse. Standardmethoden der Soft-Lithographie verwendet werden, um vaskuläre mimetischen mikrofluidischen Kammern (VMMC), die direkt an kultivierten EG Monoschichten gebunden microfabricate. 1 Diese Vorrichtungen haben den Vorteil der Verwendung von kleinen Mengen von Reagenzien, währendBereitstellung einer Plattform für direkte Abbildung der entzündlichen Ereignissen an der Membran der EG ausgesetzt zu einer gut definierten Scherfeld. Wir haben erfolgreich diese Geräte angewandt, um Zytokin-, 2 Lipid-3, 4 und RAGE-induzierte Entzündung in fünf menschlichen Aorten-EG (HAEC) zu untersuchen. Hier dokumentieren wir die Nutzung des VMMC zu Assay Monozytenzelllinie (THP-1) Roll-und Festnahme am HAEC Monoschichten, die unter Scher-Differential Eigenschaften bedingt sind und aktiviert durch die inflammatorischen Zytokins TNF-α. Studien wie diese bieten mechanistische Einblicke in atherosusceptibility unter metabolischen Risikofaktoren.
Protocol
Discussion
Wir beschreiben die Verwendung von mikrofluidischen PDMS Vorrichtungen zur On-Chip-Bewertung der endothelialen entzündlichen Phänotyp durch die Echtzeit-Bildgebung von CAM-Expression und Monozytenadhäsion. Ein großer Vorteil unseres Ansatzes liegt in der Fähigkeit, die Ergebnisse mit einer endothelialen Dysfunktion in Zellen, die Entzündungsmediatoren wie diätetische Lipide und Zytokine unter definierten hydrodynamischen Bedingungen, die Schubspannung spiegeln in atherogenen Gefäßen zu quantifizieren. Die VMMC …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH / NHLBI Zuschuss R01 HL082689 zu Scott I. Simon und Anthony G. Passerini unterstützt.
Materials
| Item | Company | Catalogue Number |
| 100 x 20mm Petri Dishes | BD Falcon | 353003 |
| Ethanol 95% | EMD Chemicals | EX0290-1 |
| DPBS | Cellgro | 21-031-CV |
| Type I Rat Tail Derived Collagen | Gibco | A10483-01 |
| Human Aortic Endothelial Cells | Genlantis | PH30405A |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Invitrogen | 15240-062 |
| Endothelial BulletKit | Lonza | CC-4176 |
| Endothelial Basal Media-2 | Lonza | CC-3156 |
| 10 ml Syringes | BD Falcon | 309604 |
| Polyurethane tubing | Tygon | ABW0001 |
| Leibovitz-15 Media | Gibco | 11415-069 |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 184 |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | 184 |
| SU8 Photoresist Master Wafer | UC Davis Pan Lab | N/A |
| Eclipse TE200 Inverted Microscope | Nikon | Eclipse TE200 |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD2000 |
| 19 gauge hypodermic needle | Kendall | 8881 |
| THP-1 Monocytic Cell Line | ATCC | TIB-202 |
| HBSS (Hanks Buffered Saline Solution) with Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14025-092 |
| Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) | R&D Systems | 210-TA-010 |
| Stromal Derived Factor – 1 (SDF-1) | R&D Systems | 350-NS-010 |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV |
| Human Serum Albumin (HSA) | ZLB Behring | NDC 0053-7680-32 |
Table 2. Specific reagents and equipment.
References
- Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte–endothelial inflammatory response. Lab Chip. 7, 448-456 (2007).
- Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I. Spatial regulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a linear gradient of shear stress. Microcirculation. 15, 311-323 (2008).
- Ting, H. J., Stice, J. P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha. Circ. Res. 100, 381-390 (2007).
- Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, H784-H791 (2011).
- Deverse, J. S., Bailey, K. A., Jackson, K. N., Passerini, A. G. Shear stress modulates rage-mediated inflammation in a model of diabetes-induced metabolic stress. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2012).
- Dai, G., Kaazempur-Mofrad, M. R., Natarajan, S., Zhang, Y., Vaughn, S., Blackman, B. R., Kamm, R. D., Garcia-Cardena, G., Gimbrone, M. A. Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis-susceptible and -resistant regions of human vasculature. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14871-14876 (2004).
- Young, E. W., Wheeler, A. R., Simmons, C. A. Matrix-dependent adhesion of vascular and valvular endothelial cells in microfluidic channels. Lab Chip. 7, 1759-1766 (2007).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Guerraty, M. A., Passerini, A. G. Endothelial heterogeneity associated with regional athero-susceptibility and adaptation to disturbed blood flow in vivo. Semin Thromb Hemost. 36, 265-275 (2008).
- Burdge, G. C., Calder, P. C. Plasma cytokine response during the postprandial period: A potential causal process in vascular disease. Br. J. Nutr. 93, 3-9 (2005).
- Hotamisligil, G. S. Inflammation and metabolic disorders. Nature. 444, 860-867 (2006).
- Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, 868-874 (2002).
- Nigro, P., Abe, J., Berk, B. C. Flow shear stress and atherosclerosis: A matter of site specificity. Antioxid Redox Signal. 15, 1405-1414 (2011).
- Chiu, J. J., Lee, P. L., Chen, C. N., Lee, C. I., Chang, S. F., Chen, L. J., Lien, S. C., Ko, Y. C., Usami, S., Chien, S. Shear stress increases icam-1 and decreases vcam-1 and e-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 73-79 (2004).
- Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
- Helmke, B. P. Molecular control of cytoskeletal mechanics by hemodynamic forces. Physiology (Bethesda). 20, 43-53 (2005).
- Gower, R. M., Wu, H., Foster, G. A., Devaraj, S., Jialal, I., Ballantyne, C. M., Knowlton, A. A., Simon, S. I. Cd11c/cd18 expression is upregulated on blood monocytes during hypertriglyceridemia and enhances adhesion to vascular cell adhesion molecule-1. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 160-166 (2011).
- Wu, H., Gower, R. M., Wang, H., Perrard, X. Y., Ma, R., Bullard, D. C., Burns, A. R., Paul, A., Smith, C. W., Simon, S. I., Ballantyne, C. M. Functional role of cd11c+ monocytes in atherogenesis associated with hypercholesterolemia. Circulation. 119, 2708-2717 (2009).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. The Review of scientific instruments. 53, 1851-1854 (1982).
