On-Chip phénotypage endothélium inflammatoire
Summary
Chambres d'écoulement microfluidiques gravés par photolithographie et fabriqué à partir de PDMS sont appliqués à sonder les résultats fonctionnels associés à une dysfonction CE et de l'inflammation. Dans une expérience représentative, la capacité de contrainte de cisaillement différentiel de moduler l'adhésion cellulaire monocytaire à cytokine activé monocouches CE est démontrée.
Abstract
Athérogénèse est potentialisée par des anomalies métaboliques qui contribuent à un état d'inflammation systémique résultant dans la dysfonction endothéliale. Cependant, les premiers changements fonctionnels dans l'endothélium qui signifient au niveau d'un individu de risque ne sont pas directement évaluée en clinique pour aider à la stratégie de guide thérapeutique. En outre, la régulation de l'inflammation par l'hémodynamique locale contribue à la distribution spatiale non aléatoire de l'athérosclérose, mais les mécanismes sont difficiles à délimiter in vivo. Nous décrivons une approche de laboratoire-sur-une-puce basée sur la perturbation métabolique de déterminer quantitativement les événements inflammatoires dans les cellules endothéliales humaines (CE) et des monocytes dans des conditions d'écoulement précis. Les méthodes standard de lithographie douce sont utilisés pour microfabricate vasculaires mimétiques chambres microfluidiques VMMC), qui sont directement liés à la culture des monocouches de la CE. 1 Ces dispositifs ont l'avantage d'utiliser de petits volumes de réactifs, tout enfournir une plate-forme pour l'imagerie directement les réactions inflammatoires à la membrane de CE exposé à un champ de cisaillement bien définie. Nous avons appliqué avec succès ces dispositifs pour étudier les cytokines, 2 lipidique-3, 4 et 5 RAGE-induite dans l'inflammation humaine aortique CE (AHCE). Ici, nous documenter l'utilisation de la VMMC à la cellule de dosage monocytaire (THP-1) de roulement et à l'arrestation sur des monocouches de HAEC qui sont conditionnés selon des caractéristiques de cisaillement différentielles et activé par la cytokine inflammatoire TNF-α. Des études comme celles-ci fournissent une approche mécanistique dans atherosusceptibility sous facteurs de risque métaboliques.
Protocol
Discussion
Nous décrivons l'utilisation de dispositifs microfluidiques en PDMS pour l'évaluation sur la puce du phénotype inflammatoire endothéliale par le biais de l'imagerie en temps réel de l'expression CAM et l'adhésion des monocytes. Un avantage majeur de notre approche réside dans la capacité à quantifier les résultats associés à une dysfonction endothéliale dans les cellules exposées à des médiateurs inflammatoires tels que les lipides alimentaires et des cytokines dans des conditions hyd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le NIH / NHLBI subvention R01 HL082689 à Scott I. Simon et Anthony G. Passerini.
Materials
| Item | Company | Catalogue Number |
| 100 x 20mm Petri Dishes | BD Falcon | 353003 |
| Ethanol 95% | EMD Chemicals | EX0290-1 |
| DPBS | Cellgro | 21-031-CV |
| Type I Rat Tail Derived Collagen | Gibco | A10483-01 |
| Human Aortic Endothelial Cells | Genlantis | PH30405A |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Invitrogen | 15240-062 |
| Endothelial BulletKit | Lonza | CC-4176 |
| Endothelial Basal Media-2 | Lonza | CC-3156 |
| 10 ml Syringes | BD Falcon | 309604 |
| Polyurethane tubing | Tygon | ABW0001 |
| Leibovitz-15 Media | Gibco | 11415-069 |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 184 |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | 184 |
| SU8 Photoresist Master Wafer | UC Davis Pan Lab | N/A |
| Eclipse TE200 Inverted Microscope | Nikon | Eclipse TE200 |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD2000 |
| 19 gauge hypodermic needle | Kendall | 8881 |
| THP-1 Monocytic Cell Line | ATCC | TIB-202 |
| HBSS (Hanks Buffered Saline Solution) with Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14025-092 |
| Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) | R&D Systems | 210-TA-010 |
| Stromal Derived Factor – 1 (SDF-1) | R&D Systems | 350-NS-010 |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV |
| Human Serum Albumin (HSA) | ZLB Behring | NDC 0053-7680-32 |
Table 2. Specific reagents and equipment.
References
- Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte–endothelial inflammatory response. Lab Chip. 7, 448-456 (2007).
- Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I. Spatial regulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a linear gradient of shear stress. Microcirculation. 15, 311-323 (2008).
- Ting, H. J., Stice, J. P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha. Circ. Res. 100, 381-390 (2007).
- Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, H784-H791 (2011).
- Deverse, J. S., Bailey, K. A., Jackson, K. N., Passerini, A. G. Shear stress modulates rage-mediated inflammation in a model of diabetes-induced metabolic stress. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2012).
- Dai, G., Kaazempur-Mofrad, M. R., Natarajan, S., Zhang, Y., Vaughn, S., Blackman, B. R., Kamm, R. D., Garcia-Cardena, G., Gimbrone, M. A. Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis-susceptible and -resistant regions of human vasculature. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14871-14876 (2004).
- Young, E. W., Wheeler, A. R., Simmons, C. A. Matrix-dependent adhesion of vascular and valvular endothelial cells in microfluidic channels. Lab Chip. 7, 1759-1766 (2007).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Guerraty, M. A., Passerini, A. G. Endothelial heterogeneity associated with regional athero-susceptibility and adaptation to disturbed blood flow in vivo. Semin Thromb Hemost. 36, 265-275 (2008).
- Burdge, G. C., Calder, P. C. Plasma cytokine response during the postprandial period: A potential causal process in vascular disease. Br. J. Nutr. 93, 3-9 (2005).
- Hotamisligil, G. S. Inflammation and metabolic disorders. Nature. 444, 860-867 (2006).
- Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, 868-874 (2002).
- Nigro, P., Abe, J., Berk, B. C. Flow shear stress and atherosclerosis: A matter of site specificity. Antioxid Redox Signal. 15, 1405-1414 (2011).
- Chiu, J. J., Lee, P. L., Chen, C. N., Lee, C. I., Chang, S. F., Chen, L. J., Lien, S. C., Ko, Y. C., Usami, S., Chien, S. Shear stress increases icam-1 and decreases vcam-1 and e-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 73-79 (2004).
- Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
- Helmke, B. P. Molecular control of cytoskeletal mechanics by hemodynamic forces. Physiology (Bethesda). 20, 43-53 (2005).
- Gower, R. M., Wu, H., Foster, G. A., Devaraj, S., Jialal, I., Ballantyne, C. M., Knowlton, A. A., Simon, S. I. Cd11c/cd18 expression is upregulated on blood monocytes during hypertriglyceridemia and enhances adhesion to vascular cell adhesion molecule-1. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 160-166 (2011).
- Wu, H., Gower, R. M., Wang, H., Perrard, X. Y., Ma, R., Bullard, D. C., Burns, A. R., Paul, A., Smith, C. W., Simon, S. I., Ballantyne, C. M. Functional role of cd11c+ monocytes in atherogenesis associated with hypercholesterolemia. Circulation. 119, 2708-2717 (2009).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. The Review of scientific instruments. 53, 1851-1854 (1982).
