단일 합성 Curli 오페론을 생성하여 공학 점착성의 박테리아를
Summary
합성 오페론 인코딩 모두 분비 장치와 curli 섬유의 구조 단량체의 디자인이 설명되어 있습니다. 이 amyloids와 자기편 고분자의 과잉은의 준수 측정 게인을 할 수 있습니다<em> E. 대장균</em> 섀시<sup> 1</sup>. 준수를 시각화하고 정량화하기 쉬운 방법이 설명되어 있습니다.
Abstract
여기에 설명 된 방법은 E. 디자인을 변경해에 구성 강하고 금속 overinducible 발기인의 통제하에 curli 유전자의 최소 수를 조립하여, 그리고 세균 준수의 결과 이득을 시각화하고 정량화에 대장균을 준수 속성. 이 방법은 적절한 엔지니어링 추상화의 원리 및 합성 생물학의 표준화 및 BBa_K540000 Biobrick의 결과 (가장 새로운 Biobrick 장치, 설계, iGEM 2011) 적용됩니다.
첫 번째 단계는 야생 타입 스트레인의 준수 능력을 증가에 따라서 금속에 대한 응답으로 curli의 과잉에 전념 합성 오페론의 디자인으로 구성합니다. 원래 curli 오페론은 전사와 병진 신호를 최적화하고 curli의 "자연"규정을 탈출하기 위해 silico에 바뀌 었습니다. 이 방법은 성공 curli 생산의 현재 이해를 테스트 할 수있었습니다. MoreoveR은, 간단한 금속 규제 발기인으로 내생 복잡한 발기인 (10 개 이상의 전사 규제가 확인)를 전환하여 curli 규정을 단순화하는 것은 제어 할보다 쉽게 준수합니다.
두 번째 단계는 간단한 방법의 구현으로 준수 능력의 질적 및 양적 평가를 포함하고 있습니다. 이러한 방법은 biofilm 형성에 관여 생물학적 구조에 관계없이 자기편 박테리아의 큰 범위에 적용됩니다. 24 잘 폴리스티렌 판에 준수 테스트 크리스탈 바이올렛 염색 후 세균 biofilm의 빠른 사전 시각화를 제공합니다. 이 질적 시험은 준수의 비율을 정량화하여 날카롭게 할 수 있습니다. 이러한 방법은 매우 간단하지만, 좋은 반복성과 재현성을 모두 이전 한 설명으로 만 크리스탈 바이올렛 염색보다 더 정확합니다. 형광 또는 레이저 믿어으로 유리 슬라이드에 GFP 태그 박테리아의 시각화ocal 현미경은 현상을 직접 관찰하여 24 잘 판 테스트를 얻은 결과를 강화 할 수 있습니다.
Introduction
비 생물 적 지원 세균 준수는 bioremediation, biocatalysis 또는 미생물 연료 전지에서 중요한 역할을 담당하고 있습니다. Bioremediation 공정은 유기 물질을 저하하거나 금속 분포 (고정, 휘발) 또는 분화를 수정 미생물의 용량을 사용합니다. 이러한 유익한 활동은 산업 및 국내 폐기물의 오염 물을 치료하기 위해 개발 된 인공 시스템에서도 수중 및 지상 생태계에서 관찰하지만 수 있습니다. 미생물 활동의 강도와 품질뿐만 아니라 미생물의 라이프 스타일 (자유 부동 또는 biofilm에 포함)에, physico – 화학 요소에 따라 달라집니다. biofilm 형성은 다양한 메커니즘에 의해 biocides에 대한 저항력을 증진 신진 대사와 연결되어 있습니다. 이러한 현상 따라서 대부분의 bioremediation 프로세스에 권장됩니다. 또한, biofilm 형성을 제어 할 수 엔지니어링 대장균 세포가 성공적으로 적용되었습니다biochips 2-3에서 전체 셀 센서를 고정.
금속의 높은 농도에 대한 미생물의 적응은 셀에 금속을 집중 할 수 다양한 세포 외 기질 구성 요소에 같은 흡착과 같은 메커니즘, 유출 펌프의 작동 또는 특정 이동 통신 사업자를 통해 발생합니다. 유전 공학을 통해이 박테리아 활동을 증폭하는 것은 특히 Raghu 외 의해 설명 된대로 약한 수량에 높은 독성 금속의 경우, 실험실 규모의 금속 오염의 효율적이고 저렴한 치료를 할 수 있습니다. 2,008 4. 세균 개선이 경우에는 이온 교환 수지를 사용하여 클래식 화학 공정에 비해 경쟁력과 비용을 절약 방법을 나타냅니다. 저자는 E. 설명 대장균 섀시는 유 전적으로 여러 사본을 변형하여 다음의 플라스미드 수 있도록 과잉을 유출 펌프 인코딩 유전자 rcnA을 패고, 그리고에 의해 코발트 이해와 첫 보존을위한 설계코발트에 대한 우대 이해와 전송이 있습니다. 이러한 긴장은 방사능이 유출 치료 이온 교환 수지에 대한 효율적인 대안으로 보이지만 핵심 해결되지 않은 문제는 프로세스 (4)의 말에 오염 된 세균의 회복입니다. 우리 연구의 목적은 유리 또는 플라스틱과 같은 비 생물 적 지원에 대항 할 수있는 맞춤 디자인 스트레인 할 수 엔지니어링하는 것이했습니다.
adhesins 및 그람 박테리아에서 확인 자기편 fimbriae의 전체 세트 사이, 우리는 curli 생산을 허용하는 시스템을 설계하기로 결정했습니다. Curli는 E.에서 돌출 얇은 (2-5 나노 미터 직경)와 매우 aggregative 아밀로이드 섬유 아르 비 결정과 불용성 매트릭스 5-7로 대장균 및 살모넬라 균의 표면. Curli도 비 생물 적 표면과 biofilms 8 개발의 식민지에 참여하고 있습니다. Curli 최근 수은 이온에게 9 바인딩 게재되었습니다. Amyloids은 실제로 높은 가지고하는 것으로 알려져 있습니다이러한 잘라 내기 : 2 금속 이온에 대한 친화력 +, 아연 2 +와 철 3 + 10. 이 속성은 더 이상 금속 오염 유출 물들의 정화를 개선 할 수 있습니다. CSG 클러스터는 curli 섬유의 생산을 책임지고 두 divergently 베꼈 operons (그림 1)의 형성되어 있습니다. csgB, csgA 및 csgC 유전자는 두 curli의 subunits, CsgA 및 CsgB을 인코딩 감각의 오페론를 구성합니다. CsgC는 curli의 biogenesis 시스템 내에서 산화 환원 활동에 참여하고 기공 동작 11 CsgG에 영향을 보인다. 그러나, curli – 생산 박테리아의 대부분의 csgC의 부재는 해당 단백질이 curli의 biogenesis 제어 만 secundary 수준을 제공했음을 나타냅니다. 시스템을 단순화하기 위해, 우리는 유전자의 최소 수와 작동하도록 선택되었습니다.
csgDEFG는 규정 및 운송에 필수적인 단백질을 operonencodesCsgA와 CsgB의 세포 표면에. CsgD는 csgBAC 오페론의 전사 활성이며, curli의 fimbriae 및 셀룰로오스 12 다른 biofilm 구성 요소의 생산을 제어하여과 억제 편모 생산 13의 biofilm 형성의 제어에 중요한 역할을 담당하고 있습니다. CsgE, CsgF과 CsgG는 주요 curli subunit 단백질 CsgA은 수용성 단백질로 분비되는 통해 외부 – 막에 curli 특정 분비 장치를 구성합니다. CsgA의 중합은 막에 바인딩 nucleator 단백질 CsgB (14에서 검토)에 생체에 따라 달라집니다. 여러 두 구성 요소 시스템을 포함하는 복잡한 규제 경로는 curli 유전자 발현 15-16을 제어하는 표시되었습니다. 이러한 복잡한 규정은 박테리아가 환경 단서에 대한 응답으로 curli 생산을 통해 두꺼운 biofilms를 형성 할 수 있지만, 산업용 애플리케이션을위한 제어하기가 어렵습니다. 메트로폴리스의 회복을 촉진하기산업 과정에서 박테리아를 알이 – 박제, 고체 지원 세균 고정은 참으로 잘 정의 된 매개 변수 (들)에 의해 제어해야합니다. curli의 점착성의 속성들은 아밀로이드 자연 17에 연결되어 bioremediation 프로세스를 개선하는 데 사용할 수 있지만, 간단하고 쉽게 제어 장치가 만들어 져야한다.
이 일곱 유전자 18 사이, 5 세트가 절대적으로 curli 합성 (csgB 및 csgA 인코딩 섬유 단량체)와 수출 (csgE csgF와 csgG, curli 분비물 복잡한 인코딩)에 대한 유전자 필요는 합성 오페론을 구성하는 선정되었다. curli의 "자연"규정, 설계 및 합성 된 강력하고 코발트 – overinducible 발기인 (그림 2)의 통제하에이 5 CSG 유전자를 포함하는 합성 오페론을 탈출 할 수 있습니다. curli 인코딩 지역의 단계별 분석 및 기능 SYN에 대한 설계 절차thetic 오페론이 설명되어 있습니다. 폴리스티렌과 유리에 세균 준수를 시각화하고 정량화하는 방법에는 다음 두 가지 방법이 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
중요 단계
이 합성 생물학의 접근에서 가장 중요한 단계는 유전자 디자인입니다. 합성 유전자 디자인은 효율적인 시스템 생산을 보장 할 수 세심한 할 수 있습니다. 핵 유출의 바이오 정화, 자신의 분비 시스템에 관련된 단백질을 인코딩 섬유 단량체 세 유전자를 인코딩 두 유전자는 소설 응용 프로그램을위한 새로운 기능 단위를 만들려면 강력한 금속 inducible 발기인으로 조립…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 리옹 인사 – 엔터프라이즈 네트워크의 iGEM 팀 (Viviane Chansavang, 마틸다 Dumond, 알렉산더 Duprey, 멜라니 Geffroy, Clémence Gonthier, 마고 Jaulin, 아루 레이 하겐, Goki 리, 토마스 Poinsot, 베릴 Royer – 버트 란드, 줄리 Soula, 마이클 Vonzy의 다른 회원들에게 감사 , 피에르 이브 Zundel, Soufiane Bouhmadi, 올리비에 Brette, 게일 Chambonnier, 로라 Izard, Aurianne Kroiss, 필립 Lejeune, 아그네스 Rodrigue, 아르노 Rondelet, Sylvie Reverchon와 발레리 Desjardin)의 재정적 인 지원을위한 후원자 (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation 인사, 엔터프라이즈 네트워크 – 리옹 (Lyon)과 Biosciences 인사 – 리옹 (Lyon)의 부), 중요한이 원고의 읽기, 스트레인 선물 박사 CC의 Sze를위한 F. Wisniewski – 염료. 작살 줄에 달린 부표 B.는 박사 학위를받은 지역 론 알프에서 교제.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| pIG2 | pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn–csgBAEFG operon ; Ampr | ||
| pUC18 | Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr | ||
| S23 | SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0,1M stock solution kept at Room Temperature | |
| M63 | 29 | ||
| 24-well plate | Nunc | 55429 | Polystyrene 24-well plates |
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