Ingegneria batteri aderenti mediante la creazione di un unico sintetico curli Operon
Summary
La progettazione di un operone codifica sintetico sia l'apparato secretorio ei monomeri di fibre strutturali curli è descritto. Sovrapproduzione di questi amiloidi e polimeri aderenti permette un guadagno misurabile di aderenza del<em> E. coli</em> Telaio<sup> 1</sup>. Un modo semplice per visualizzare e quantificare l'aderenza sono spiegato.
Abstract
Il metodo qui descritto consiste nel ridisegnare E. aderenza proprietà coli assemblando il numero minimo di curli geni sotto il controllo di un promotore forte e metallo-overinducible, e nella visualizzazione e quantificare il guadagno risultante di adesione batterica. Questo metodo si applica principi di ingegneria appropriati di astrazione e la normalizzazione della biologia sintetica, e risultati in Biobrick BBa_K540000 (Miglior dispositivo Biobrick nuovo, progettato, iGEM 2011).
La prima fase consiste nella progettazione dell'operone sintetico dedicato sovrapproduzione curli in risposta al metallo, e quindi ad aumentare le capacità di aderenza del ceppo di tipo selvatico. L'originale curli operone è stato modificato in silico al fine di ottimizzare i segnali trascrizionali e traslazionali e sfuggire alla regolazione "naturale" di curli. Questo approccio ha permesso di testare con successo la nostra attuale comprensione della produzione curli. Moreover, semplificando la regolazione curli commutando il promotore endogeno complesso (più di 10 regolatori trascrizionali identificati) per un semplice metallo promotore regolato rende aderenza molto più facile da controllare.
La seconda fase prevede la valutazione qualitativa e quantitativa delle capacità di adesione mediante applicazione di metodi semplici. Questi metodi sono applicabili ad una vasta gamma di batteri aderenti indipendentemente strutture biologiche coinvolte nella formazione di biofilm. Prova di aderenza in piastre da 24 pozzetti in polistirene fornisce una visualizzazione rapida preliminare del biofilm batterico dopo colorazione violetto cristallo. Questo test qualitativo può essere affilata per la quantificazione della percentuale di adesione. Tale metodo è molto semplice ma più accurato solo colorazione viola cristallo come descritto in precedenza con 1 sia una buona ripetibilità e riproducibilità. Visualizzazione di batteri GFP-tagged su vetrini con la fluorescenza o conf lasermicroscopia Ocal permette di rafforzare i risultati ottenuti con il 24 pozzetti piastra prova mediante osservazione diretta del fenomeno.
Introduction
L'adesione batterica al supporto abiotico svolge un ruolo importante nelle celle a combustibile biorisanamento, biocatalisi o microbica. Processi di biorisanamento utilizzare le capacità dei microrganismi di degradare sostanze organiche, o per modificare la distribuzione del metallo (immobilizzazione, volatilizzazione) o speciazione. Queste attività benefiche sono osservati negli ecosistemi acquatici e terrestri, ma anche nei sistemi artificiali sviluppati per il trattamento di acque inquinate di rifiuti industriali e domestici. L'intensità e la qualità dell'attività microbica dipendono fattori fisico-chimici, ma anche sullo stile di vita dei microrganismi (free-floating o incorporato in biofilm). La formazione di biofilm è associato un metabolismo promuovere resistenza ai biocidi da meccanismi diversi. Questo fenomeno sarà dunque incoraggiata maggior parte dei processi di biorisanamento. Inoltre, ingegneria cellule di Escherichia coli per controllare la formazione di biofilm è stato applicato con successoimmobilizzare cellule intere sensori su biochip 2-3.
Adattamento dei microrganismi a concentrazione di metalli avviene attraverso diversi meccanismi quali adsorbimento a componenti della matrice extracellulare, attivazione della pompa di efflusso o di vettori specifici in grado di concentrare il metallo nella cella. Incrementare queste attività batteriche tramite ingegneria genetica consente trattamento efficiente ed economico di inquinamento da metalli in scala di laboratorio, in particolare nel caso di metalli altamente tossici in quantità debole come descritto da Raghu et al. 2008 4. Bonifica batterica rappresenta in questo caso un metodo di risparmio e costo competitivo rispetto ai processi chimici classici con resine a scambio ionico. Gli autori hanno descritto un E. telaio coli geneticamente modificati per l'assorbimento e la ritenzione cobalto prima battendo l'efflusso pompa gene che codifica rcnA, e poi la trasformazione con una copia più plasmide sovrapproduzione permettendo di untrasportatore con captazione preferenziale per il cobalto. Tale ceppo appare come una valida alternativa alle resine a scambio ionico per il trattamento di effluenti radioattivi, ma una questione chiave irrisolta è il recupero di batteri contaminate al termine del processo 4. L'obiettivo del nostro lavoro è stato quindi di progettare una custom-designed ceppo in grado di attenersi ai supporti abiotici quali il vetro o plastica.
Tra l'insieme delle adesine e fimbrie aderente identificati batteri Gram-, abbiamo scelto di progettare un sistema che consenta di produzione curli. Curli sono fibre amiloidi sottili (2-5 nm di diametro) e altamente aggregativa che sporgono dalla E. coli e Salmonella superficie come matrice non cristallino e insolubile 5-7. Curli sono anche coinvolti nella colonizzazione delle superfici abiotiche e lo sviluppo di biofilm 8. Curli sono stati recentemente dimostrato di legare ioni di mercurio 9. Amiloidi sono infatti noti per possedere elevataaffinità per ioni di metalli come Cu 2 +, Zn 2 + e Fe 3 + 10. Questa proprietà potrebbe migliorare ulteriormente la decontaminazione di metallo effluenti inquinati. Il cluster CSG è responsabile per la produzione di fibre curli ed è costituito da due operoni trascritti divergentemente (Figura 1). L', CSGB csgA e geni csgC costituiscono l'operone senso, codifica le due subunità curli, CsgA e CSGB. CsgC sembra essere coinvolto in attività redox all'interno del sistema biogenesi curli e di influenzare il comportamento dei pori CsgG 11. Tuttavia, l'assenza di csgC nella maggior parte dei batteri produttori curli indica che la proteina corrispondente fornisce solo un livello secondario di controllo sulla biogenesi curli. Per semplificare il sistema, abbiamo scelto di lavorare con il minimo numero di geni.
Il csgDEFG operonencodes proteine essenziali nella regolazione e trasportodi CsgA e CSGB alla superficie cellulare. CsgD è un attivatore trascrizionale dell'operone csgBAC e svolge un ruolo chiave nel controllo della formazione di biofilm controllando la produzione delle fimbrie curli e altri componenti biofilm come cellulosa 12 e inibendo la produzione flagellum 13. CsgE, CsgF e CsgG costituiscono una curli-specifico apparato secretorio nella membrana esterna attraverso cui viene secreto principali curli subunità proteica CsgA come proteina solubile. La polimerizzazione di CsgA dipende in vivo sulla membrana legata nucleator proteina CSGB (recensione in 14). Complessi percorsi regolatori coinvolgono diversi sistemi a due componenti hanno dimostrato di controllare l'espressione del gene curli 15-16. Questi regolamenti complessi permettere ai batteri di formare biofilm di spessore attraverso la produzione curli in risposta a stimoli ambientali, ma sono difficili da controllare per applicazioni industriali. Per facilitare il recupero della metal-farcito batteri durante un processo industriale, fissazione batterica ad un supporto solido deve effettivamente essere controllato dal parametro ben definito (s). Le proprietà di aderenza di curli sono legati alla loro natura amiloide 17 e potrebbe essere utilizzata per migliorare i processi di biorisanamento, ma un dispositivo semplice e facilmente controllato deve essere creato.
Tra questi 7 geni 18, una serie di cinque geni assolutamente necessaria per curli sintesi (CSGB e csgA monomeri fibra codifica) e l'esportazione (csgE csgF e csgG, che codifica il complesso secrezione curli) sono stati selezionati per costruire l'operone sintetico. Per sfuggire alla regolazione "naturale" di curli, un operone sintetico composto da questi 5 geni CSG sotto il controllo di un promotore forte e cobalto-overinducible (Figura 2) è stato progettato e sintetizzato. Il passo-passo analisi della curli-regione codificante e la procedura di progettazione di un funzionale synsintetico dell'operone sono descritti. Due metodi per visualizzare e quantificare l'adesione batterica al polistirolo e vetro sono spiegato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passaggi critici
La fase più critica in questo approccio biologia sintetica è la progettazione gene. Disegno gene sintetico deve essere meticolosa per garantire un sistema di produzione efficiente. Due geni codificanti i monomeri fibra e tre geni codificanti per proteine coinvolte nel loro sistema di secrezione sono stati montati con un promotore forte e metallo-inducibile per creare una nuova unità funzionale per una nuova applicazione: il bio-decontaminazione di effluente nucleare. C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo gli altri membri della squadra di INSA-ENS iGEM Lione (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Mélanie Geffroy, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Ly Goki, Thomas Poinsot, Béryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy , Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon e Valérie Desjardin), i nostri sponsor per il loro sostegno finanziario (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lione e il Dipartimento di Bioscienze INSA-Lyon), F. Wisniewski-Dyé per la lettura critica di questo manoscritto e il dottor Sze CC per il regalo ceppo. Drogue B. riceve un dottorato di ricerca borsa di studio Région Rhône-Alpes.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| pIG2 | pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn–csgBAEFG operon ; Ampr | ||
| pUC18 | Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr | ||
| S23 | SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0,1M stock solution kept at Room Temperature | |
| M63 | 29 | ||
| 24-well plate | Nunc | 55429 | Polystyrene 24-well plates |
References
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. Microbial sensor cell arrays. Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).
- Melamed, S. A printed nanolitre-scale bacterial sensor array. Lab Chip. 11, 139-146 (2011).
- Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).
- Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. Nature. 338, 652-655 (1989).
- Prigent-Combaret, C., et al. Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).
- Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science. 295, 851-855 (2002).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II). Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).
- Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer’s A beta peptide studied by fluorescence. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).
- Taylor, J. D., et al. Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis. Structure. 19, 1307-1316 (2011).
- Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).
- Pesavento, C., et al. Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli. Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).
- Dueholm, M. S., et al. Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation. 생화학. 50, 8281-8290 (2011).
- Jubelin, G., et al. CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli. J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).
- Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis. J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).
- Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive. J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).
- Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).
- Blaha, D. The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt. Biochimie. 93, 434-439 (2011).
- Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context. J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).
- Perrin, C. Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).
- Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).
- Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C., Callow,, J., Smith, A. M. . Biological Adhesives. , (2006).
- Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device. Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).
- Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria. J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).
- Miller, J. E. . Experiments in molecular genetics. , (1972).
