Engineering adhärenten Bakterien durch Schaffung eines einheitlichen Synthetic Curli Operon
Summary
Das Design eines synthetischen Operon kodiert sowohl den sekretorischen Apparat und den strukturellen Monomere Curli Fasern beschrieben. Überproduktion dieser Amyloide und Anhänger Polymere ermöglicht einen messbaren Gewinn der Einhaltung der<em> E. coli</em> Chassis<sup> 1</sup>. Einfache Möglichkeiten zur Visualisierung und Quantifizierung Einhaltung erläutert.
Abstract
Die hier beschriebene Methode besteht in der Neugestaltung E. coli Hafteigenschaften durch Zusammensetzen der Mindestanzahl von Curli Gene unter der Kontrolle eines starken und Metall-overinducible Promotor und bei der Visualisierung und Quantifizierung der erhaltenen Verstärkung der bakteriellen Adhärenz. Diese Methode gilt entsprechende technische Prinzipien der Abstraktion und Standardisierung der synthetischen Biologie, und die Ergebnisse in der BBa_K540000 BioBrick (Best neuen BioBrick Gerät entwickelt, iGEM 2011).
Der erste Schritt besteht in der Konstruktion des synthetischen Operon gewidmeten Curli Überproduktion in Reaktion auf Metall, und daher bei der Erhöhung der Adhärenz Fähigkeiten des Wildtypstamms. Die ursprüngliche curli Operon wurde in silico modifiziert, um Transkription und Translation-Signale zu optimieren und die Flucht der "natürliche" Regulierung der curli. Dieser Ansatz erlaubt es, mit Erfolg testen unser gegenwärtiges Verständnis von curli Produktion. Moreover, Vereinfachung des Curli Regulierung durch Schalten des endogenen Komplexes Promotor (mehr als 10 transkriptionellen Regulatoren identifiziert) zu einem einfachen Metall-regulierten Promotor macht Adhärenz viel einfacher zu steuern.
Der zweite Schritt beinhaltet qualitative und quantitative Bewertung der Einhaltung Fähigkeiten durch Umsetzung von einfachen Methoden. Diese Verfahren sind für eine große Palette von anhaftenden Bakterien unabhängig von biologischen Strukturen im Biofilm-Bildung beteiligt. Adherence Test im 24-well Polystyrol-Platten bietet eine schnelle vorläufige Visualisierung des bakteriellen Biofilms nach Kristallviolettfärbung. Dieser qualitative Test kann durch die Quantifizierung der Prozentsatz der Einhaltung geschärft werden. Ein solches Verfahren ist sehr einfach, aber genauer als nur Kristallviolettfärbung wie vorher 1 mit sowohl einer guten Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit beschrieben. Visualisierung von GFP-markierten Bakterien auf Glasträger durch Fluoreszenz-oder Laser-confocal Mikroskopie ermöglicht, um die Ergebnisse mit dem 24-Well-Platte-Test durch direkte Beobachtung des Phänomens erhalten stärken.
Introduction
Bakterielle Adhärenz gegenüber abiotischen Unterstützung spielt eine wichtige Rolle in Bioremediation, Biokatalyse oder mikrobielle Brennstoffzellen. Bioremediation Prozesse verwenden, die Kapazitäten von Mikroorganismen an organischen Substanzen zersetzen, oder um die Metallverteilung (Immobilisierung, Verflüchtigung) oder Speziation ändern. Diese positiven Aktivitäten sind in aquatischen und terrestrischen Ökosysteme beobachtet, sondern auch in den künstlichen Systeme entwickelt, um verschmutztes Wasser von Industrie-und Hausmüll zu behandeln. Die Intensität und die Qualität der mikrobiellen Aktivität auf die physikalisch-chemische Faktoren abhängen, sondern auch von der Lebensweise der Mikroorganismen (frei schwebenden oder eingebettet in Biofilm). Die Biofilmbildung ist mit einem Stoffwechsel fördern Resistenz gegen Biozide durch diverse Mechanismen verbunden. Dieses Phänomen wird daher in den meisten Prozessen Bioremediation gefördert werden. Außerdem hat Engineering Escherichia coli-Zellen, um die Biofilmbildung steuern erfolgreich angewendetimmobilisieren whole-cell-Sensoren auf Biochips 2-3.
Adaption von Mikroorganismen zu hohe Konzentration an Metallen erfolgt über verschiedene Mechanismen, wie Adsorption an Komponenten der extrazellulären Matrix, die Aktivierung von Effluxpumpe oder spezifische Träger, die das Metall in die Zelle zu konzentrieren. Die Förderung dieser bakteriellen Aktivitäten über Gentechnik ermöglicht eine effiziente und billige Behandlung von Metall-Verschmutzung im Labormaßstab, insbesondere im Falle hoch giftiger Metalle in schwachen Menge von Raghu et al. 2008 4. Bakterielle Sanierung stellt in diesem Fall eine wettbewerbsfähige und kostensparende Methode im Vergleich zu den klassischen chemischen Prozessen unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen. Die Autoren beschreiben eine E. coli genetisch Chassis für Kobalt Aufnahme und Retention zuerst durch Ausschlagen der Effluxpumpe kodierenden Gen RCNA und dann durch Transformation mit einem Plasmid mit mehreren Kopien ermöglicht eine Überproduktion von entworfenTransporter mit bevorzugte Aufnahme für Cobalt. solcher Stamm erscheint als Alternative zu Ionenaustauscherharzen zu behandeln radioaktives Abwasser, sondern ein Schlüssel ungelöstes Problem ist die Rückgewinnung von kontaminierten Bakterien am Ende des Prozesses 4. Das Ziel unserer Arbeit war es daher, Ingenieur eine speziell angefertigte Belastung in der Lage, gegenüber abiotischen Trägern wie Glas oder Kunststoff haften.
Unter der Gesamtheit der Adhäsine und Anhänger Fimbrien in Gram-Bakterien identifiziert, entschieden wir uns für ein System, curli Produktion zu entwerfen. Curli sind dünn (2-5 nm Durchmesser) und hoch aggregativen Amyloidfasern, die ragen aus dem E. coli und Salmonella Oberfläche als eine nicht-kristalline als auch unlösliche Matrix 5-7. Curli sind auch in der Besiedlung des abiotischen Oberflächen und die Entwicklung von Biofilmen 8 beteiligt. Curli wurden kürzlich gezeigt, binden Quecksilber-Ionen 9. Amyloide sind in der Tat bekannt, besitzen eine hoheAffinität für Metallionen wie Cu 2 +, Zn 2 + und Fe 3 + 10. Diese Eigenschaft könnte die weitere Verbesserung der Dekontamination von Metall verunreinigte Abwässer. Die CSG-Cluster ist verantwortlich für die Produktion von curli Fasern und besteht aus zwei divergent transkribierte Operons (Abbildung 1), gebildet. Die CSGB, CsgA und CSGC Gene bilden die Sinne Operon codiert die beiden curli Untereinheiten, CsgA und CSGB. CSGC scheint zu sein, beteiligt Redox-Aktivität innerhalb der curli Biogenese und zu beeinflussen CsgG Poren Verhalten 11. Allerdings zeigt die Abwesenheit von CSGC in der Mehrzahl der Curli produzierenden Bakterien, dass das entsprechende Protein nur einen sekundären Maß an Kontrolle über die Curli Biogenese bereitstellt. Um das System zu vereinfachen, haben wir ausgewählt, um mit einer minimalen Anzahl von Genen zu arbeiten.
Die csgDEFG operonencodes Proteine essentiell bei der Regulierung und Transportvon CsgA und CSGB zur Zelloberfläche. CsgD ist ein Transkriptionsaktivator der csgBAC Operon und spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Biofilmbildung durch Steuern der Erzeugung von Fimbrien Curli und andere Komponenten, wie Biofilm Cellulose 12 und durch die Hemmung der Produktion Flagellum 13. CsgE, CSGF und CsgG darstellen Curli-spezifischer sekretorischer Vorrichtung in der äußeren Membran, durch die der großen Untereinheit-Protein Curli CsgA als lösliches Protein sezerniert wird. Die Polymerisation von CsgA hängt in vivo an der membrangebundenen Proteins CSGB Nukleator (besprochen in 14). Komplexen Regulationsmechanismen, die mehrere Zweikomponentensysteme erwiesen sich Curli Genexpression 15-16 steuern. Diese komplexen Vorschriften erlauben Bakterien dicke Biofilme über die curli Produktion als Reaktion auf Umweltreize zu bilden, sind aber schwer zu für industrielle Anwendungen zu steuern. Um die Erholung der met erleichternal-gestopft Bakterien während eines industriellen Prozesses, bakterielle Fixierung auf einem festen Träger in der Tat muss von gut definierten Parameter (n) gesteuert werden. Die adhärenten Eigenschaften Curli sind, ihre Natur Amyloid 17 verbunden und könnten zur Bioremediation Prozesse zu verbessern, sondern ein einfacher und leicht zu kontrollierenden Gerät geschaffen werden.
Von diesen 7 Gene 18, einen Satz von 5 absolut Gene für Curli Synthese (CSGB und CsgA Codierung Faser Monomere) und Ausfuhr (csgE CSGF und csgG, Codieren des Curli Sekretion Komplex) benötigt wurden ausgewählt, um die synthetischen Operon konstruieren. Um das "natürliche" Regulierung der curli, ein synthetisches Operon aus diesen 5 csg Gene unter der Kontrolle eines starken und Kobalt-overinducible Promotor (Abbildung 2) wurde entworfen und synthetisiert entkommen. Der Schritt-für-Schritt-Analyse des Curli kodierende Region und die Konstruktionsverfahren für eine funktionelle synthetische Operons beschrieben. Zwei Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung bakterielle Adhärenz an Polystyrol und Glas werden erläutert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte
Der wichtigste Schritt in diese synthetischen Biologie Ansatz ist das Gen-Design. Synthetisches Gen-Design hat akribisch zu sein, um ein effizientes System Produktion zu gewährleisten. Die Biodekontamination kerntechnischer Abstrom: zwei Gene, die die Faser und drei Monomeren Proteine kodierenden Genen in ihrer Sekretionssystem beteiligt waren mit einem starken und Metall-induzierbaren Promotor, eine neue Funktionseinheit für eine neuartige Anwendung erstellen zusamme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken andere Mitglieder der Lyon INSA-ENS iGEM Team (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Mélanie Geffroy, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Goki Ly, Thomas Poinsot, Béryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy , Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon und Valérie Desjardin), unseren Sponsoren für ihre finanzielle Unterstützung (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lyon und dem Department of Biosciences INSA-Lyon), F. Wisniewski-Dyé für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Dr. CC Sze für Stamm Geschenk. B. Drogue erhält einen Ph.D. Stipendium Région Rhône-Alpes.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| pIG2 | pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn–csgBAEFG operon ; Ampr | ||
| pUC18 | Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr | ||
| S23 | SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0,1M stock solution kept at Room Temperature | |
| M63 | 29 | ||
| 24-well plate | Nunc | 55429 | Polystyrene 24-well plates |
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