Engenharia bactérias aderentes pela criação de um único sintético Curli Operon

Summary

A concepção de um operão que codifica tanto o aparelho sintético de secreção e os monómeros estruturais de curli fibras é descrito. A superprodução destas amilóides e polímeros aderentes permite um ganho mensurável de aderência do<em> E. coli</em> Chassis¹. Maneiras fáceis de visualizar e quantificar a adesão são explicados.

Abstract

O método descrito aqui consiste em redesenhar E. coli propriedades de aderência através da montagem do número mínimo de genes curli sob o controlo de um promotor forte e metal overinducible-, e em visualizar e quantificar o ganho de aderência bacteriana. Este método aplica-se princípios de engenharia adequadas de abstração e padronização da biologia sintética, e resultados no biotijolo BBa_K540000 (dispositivo Melhor biotijolo novo e projetado, iGEM 2011).

O primeiro passo consiste na concepção do operão sintético dedicada à superprodução curli em resposta a metal, e, portanto, para aumentar a capacidade de aderência da estirpe de tipo selvagem. O original foi modificado curli operon in silico, a fim de otimizar os sinais de transcrição e tradução e escapar da regulação "natural" de curli. Esta abordagem permitiu testar com sucesso a nossa compreensão atual da produção curli. Moreover, simplificando a regulação curli trocando o promotor endógeno complexo (mais de 10 identificados reguladores transcricionais) de um promotor de metal-regulada simples torna aderência muito mais fácil de controlar.

A segunda etapa inclui a avaliação qualitativa e quantitativa das habilidades de aderência por aplicação de métodos simples. Estes métodos são aplicáveis ​​a uma ampla gama de bactérias aderentes independentemente das estruturas biológicas envolvidas na formação de biofilme. Teste de aderência em placas de 24 poços de poliestireno proporciona uma visualização rápida preliminar do biofilme bacteriano após coloração com violeta de cristal. Este teste qualitativo pode ser afiada, mediante a quantificação da percentagem de aderência. Tal método é muito simples, mas mais preciso do que a coloração violeta de cristal único, como descrito anteriormente, com ^um tanto uma boa repetibilidade e reprodutibilidade. Visualização de bactérias marcadas com GFP em lâminas de vidro por fluorescência a laser ou confmicroscopia ocal permite reforçar os resultados obtidos com o teste de placa de 24 poços por observação directa do fenómeno.

Introduction

A aderência bacteriana ao suporte abiótico desempenha um papel importante em células de combustível biocatálise biorremediação, ou microbiana. Processos de biorremediação utilizar as capacidades dos microorganismos para degradar as substâncias orgânicas, ou para modificar a distribuição de metal (volatilização imobilização) ou especiação. Essas atividades benéficos são observados em ecossistemas aquáticos e terrestres, mas também nos sistemas artificiais desenvolvidos para tratar a água poluída de resíduos industriais e domésticos. A intensidade e a qualidade da actividade microbiana dependem factores físico-químicas, mas também sobre o estilo de vida dos microrganismos (flutuante ou incorporado em biofilme). A formação de biofilme está associada a um metabolismo, resistência a biocidas, por diversos mecanismos. Este fenômeno, portanto, ser incentivado na maioria dos processos de biorremediação. Além disso, as células de engenharia de Escherichia coli para controlar a formação de biofilme tem sido aplicado com sucessoimobilizar células inteiras sensores em biochips ^2-3.

Adaptação dos microrganismos a uma elevada concentração de metais ocorre por meio de diversos mecanismos, tais como a adsorção aos componentes da matriz extracelular, a activação da bomba de efluxo ou transportadores específicos capazes de concentrar o metal para dentro da célula. Impulsionando estas actividades bacterianas através da engenharia genética permite o tratamento eficaz e barata de poluição de metal, à escala laboratorial, em especial no caso de metais altamente tóxicos em quantidade fraca, tal como descrito por Raghu et al. 2008 ^4. Descontaminação bacteriana representa, neste caso, um método de poupança competitivos e de custo em comparação com os processos químicos clássicos, usando resinas de permuta iónica. Os autores descreveram uma E. chassis coli geneticamente modificada para a absorção e retenção de cobalto primeiro batendo para fora da bomba de efluxo de codificação do gene rcnA, e, em seguida, através de transformação com uma cópia múltipla a superprodução de um plasmídeo que permitatransportador com a absorção preferencial de cobalto. tal estirpe surge como uma alternativa eficiente para resinas de permuta iónica para o tratamento de efluentes radioactivos, mas um problema por resolver é a recuperação de bactérias contaminados no final do processo ^4. O objetivo do nosso trabalho foi, portanto, de projetar uma cepa de design personalizado capaz de furar a suportes abióticos, como vidro ou plástico.

Entre o conjunto de adesinas e as fímbrias aderentes identificadas em bactérias Gram-, optamos por projetar um sistema que permita a produção curli. Curli são fibras amilóides finas (2-5 mm de diâmetro) e altamente agregadora que se projetam a partir do E. coli e Salmonella de superfície como uma matriz não cristalina e insolúveis ^5-7. Curli também estão envolvidos na colonização de superfícies abióticas e para o desenvolvimento de biofilmes ^8. Curli foram recentemente mostrado para ligar iões de mercúrio ^9. Amilóides são de facto conhecidos por possuir altaafinidade por íons metálicos como Cu ^{2 +,} Zn ^{2 +} e Fe ^{3 + 10.} Essa propriedade pode melhorar ainda mais a descontaminação de metais de efluentes poluídos. O cluster csg é responsável pela produção de fibras curli e é constituído por dois operões divergentemente transcritos (Figura 1). O CSGB, csgA e genes csgC constituem o operão sentido, que codifica as duas subunidades, curli CsgA e CSGB. CsgC parece ser envolvidos na atividade redox dentro do sistema biogênese curli e afetar o comportamento dos poros CsgG ^11. No entanto, a ausência de csgC na maioria dos curli bactérias produtoras indica que a proteína correspondente fornece apenas um nível secundário de controlo sobre a biogénese curli. Para simplificar o sistema, foram escolhidos para trabalhar com o número mínimo de genes.

O csgDEFG operonencodes proteínas essenciais na regulação e transportede CsgA CSGB e para a superfície da célula. CsgD é um activador da transcrição do operão csgBAC e desempenha um papel fundamental no controlo da formação de biofilme, controlando a produção de fímbrias curli e componentes de biofilme, tais como a celulose ¹² e inibindo a produção flagelo ^13. CSGE, CsgF CsgG e constituem um aparelho secretor curli específicos na membrana exterior, através da qual a grande subunidade de proteína curli CsgA é segregada como uma proteína solúvel. A polimerização de CsgA é dependente in vivo sobre a ligada à membrana da proteína nucleador CSGB (revisto em ^14). Complexos envolvendo várias vias reguladoras de dois componentes de sistemas têm sido mostrados para controlar a expressão do gene curli ^15-16. Estes regulamentos complexos permitem que as bactérias formam biofilmes grossas através da produção curli em resposta a sugestões ambientais, mas são difíceis de controlar para aplicações industriais. Para facilitar a recuperação da metal-enchido bactérias durante um processo industrial, a fixação das bactérias a um suporte sólido, de facto tem de ser controlado pelo parâmetro bem definido (s). As propriedades aderentes da curli estão ligados à sua natureza amilóide ¹⁷ e poderiam ser utilizados para melhorar os processos de biorremediação, mas um dispositivo simples e facilmente controlada tem de ser criado.

Entre estes genes 7 ^18, um conjunto de 5 absolutamente necessário genes para a síntese de curli (CSGB e monómeros de fibra csgA de codificação) e exportação (CSGE csgF e csgG, que codifica o complexo de secreção curli) foram seleccionados para construir o operão sintético. Para escapar à regulação "natural" de curli, um operão sintético compreendendo esses genes CSG 5 sob o controlo de um promotor forte e overinducible-cobalto (Figura 2) foi desenhado e sintetizado. A análise passo-a-passo da região de codificação de curli e o procedimento para a criação de um syn funcionaltético operão são descritos. Dois métodos para visualizar e quantificar a aderência bacteriana ao poliestireno e vidro são explicados.

Protocol

1. Biotijolo Design e Síntese do Operon Curli Determinar a organização genética e localizar os sinais endógenos de transcrição e tradução dos genes curli. Estas informações são recolhidas em bancos de dados especializados, como RegulonDB um ou EcoGene b e completado por uma leitura cuidadosa das publicações pertinentes. Gestão de dados e em preanalysis silico foram realizados com Clone Gestor de software c. Selecionar as seqüências …

Representative Results

In silico anotação da seqüência tipo selvagem csg de E. coli K12 associadas com a optimização de sinais de transcrição e de tradução, permitiu conceber o único sintético curli operon P-rcn csg mostrado na Figura 3 (a sequência completa de dados suplementares). Protocolo 2 e 3 do protocolo foram usadas para visualizar e quantificar a aderência associada com a produção curli. Utilizando coloração de violeta de cristal em placas de 24 poços de poliesti…

Discussion

Etapas críticas

O passo mais crítico nesta abordagem de biologia sintética é o design gene. Projeto gene sintético tem que ser meticuloso para assegurar um sistema de produção eficiente. Dois genes que codificam para os monómeros de fibra e três genes que codificam para proteínas envolvidas no seu sistema de secreção foram montados com um promotor forte e indutivel de metal para criar uma nova unidade funcional para uma aplicação nova: a bio-descontaminação de efluentes nuclear….

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
pIG2			pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn–csgBAEFG operon ; Ampr
pUC18			Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr
S23			SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2
S24			SSC1/pUC18
CoCl2	Sigma		0,1M stock solution kept at Room Temperature
M63			29
24-well plate	Nunc	55429	Polystyrene 24-well plates