전기 화학 센서를 사용하여 세균의 검출 및 식별
Summary
우리는 빠른 세균 검출 및 식별을 위해 전기 센서 분석 방법을 설명합니다. 분석은 리보솜 RNA (rRNA의) 종의 특정 시퀀스 DNA 올리고 뉴클레오타이드 캡처 프로브 작용 센서 어레이를 포함한다. 캡처 프로브와 고추 냉이 과산화 효소 연결된 DNA 올리고 뉴클레오타이드 검출기 프로브 대상 rRNA의의 샌드위치 하이브리드는 측정 전류 측정 전류를 생성합니다.
Abstract
전기 센서가 널리 혈당의 신속하고 정확한 측정을 위해 사용되며, 분석의 다양한 검출에 적용 할 수 있습니다. 전기 센서는 유용한 전기 신호로 생물학적 인식 이벤트를 transducing에 의해 작동합니다. 신호 전달은 전류 측정 전극에 산화 환원 효소의 활동을 결합하여 발생합니다. 센서의 특이성은 고유의 효소의 특성, 포도당 센서의 경우 포도당 산화 효소 또는 효소 항체 또는 프로브 사이의 결합의 산물 중 하나입니다.
여기, 우리가 직접 감지하고 박테리아를 식별하는 전기 센서 분석 방법을 설명합니다. 모든 경우에, 여기에 설명 된 프로브 DNA 올리고 뉴클레오티드이다. 이 방법은 대상 리보솜 RNA (rRNA의)를 캡처 및 검출기 프로브 샌드위치 하이브리드를 기반으로합니다. 검출기 프로브가 시간에 연결되어있는 동안 포획 프로브는 센서 표면에 고정되어orseradish 퍼 옥시 데이즈 (HRP). 같은 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)와 같은 기판 표면에 결합 캡처 표적 탐지기 단지와 전극에 추가되면, 기판은 HRP에 의해 산화 작업 전극에 의해 감소된다. 전극에 전류 흐름을 생산, 전극에서 HRP의 기질에 의해 전자의 왕복이 산화 환원 사이클 결과.
Introduction
세균 검출 및 식별을위한 표적 분자로 rRNA를 사용하면 장점을 가지고 있습니다. 박테리아 세포의 rRNA의의 풍부한 대상 증폭 1 필요없이 밀리리터 당 250 박테리아의 낮은 민감도 제한을 제공합니다. 세균성 rRNA의가 DNA 프로브와 하이브리드 액세스 할 수있는 고유 한 종의 특정 시퀀스를 포함하고 있습니다. 따라서, 전기 센서 배열은 각 센서가 다른 종의 특정 캡처 프로브 기능화되어 알 수없는 박테리아를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 양성 대조군 센서는 "다리"캡처 및 검출기 프로브 내부 교정 신호를 생성 할 수있는 합성 올리고 뉴클레오티드 대상에 대해 포함되어야한다.
전기 센서는 기본 및 translational 연구 애플 리케이션의 넓은 범위가 있습니다. 예를 들어, 분석은 정확하게 E.의 효과를 측정하기 위해 여기에 설명 된 사용되었습니다 RRN에서 대장균의 성장 단계세균 생리학 2에 관심있는 연구자들에게 큰 관심입니다 및 사전 rRNA의 사본 번호. 전기 센서 분석의 감도는 노이즈 비율로 신호에 의해 결정됩니다. 신호 증폭 및 소음 감소 방법의 다양한 탐구되었다. 우리는 센서 표면의 화학적 성질을 개선하는 검출기 프로브 및 / 또는 HRP 효소의 비특이적 결합을 줄이는 열쇠는 사실을 알게 될 것입니다. 특히, alkanedithiols 및 mercaptohexanol의 혼합 단층이 대상 하이브리드 3 캡처 프로브의 접근성을 유지하면서 더 완전 전극 표면을 커버하여 배경을 줄이기 위해 발견되었습니다. 이러한 표면 화학 처리는 복잡한 생물 학적 샘플을 포함하는 분석에 특히 중요하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 전기 센서 분석은 핵산 표적을 신속하게 탐지 할 수 있습니다. 민감도와 특이도가 차례로 길이 캡처 및 검출기 프로브의 GC 내용에 따라 대상 프로브 하이브 리다이 제이션의 자유 에너지에 부분적으로 의존한다. 우리는 일반적으로 주위 온도 (~ 20 ° C) 5, 6에서 하이브리드 단계를 수행하십시오. 그러나 하이브리드 단계 (3.2, 3.3)는 칩이 포함 된 커버 챔버에 배치됩니다 경우…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
본 연구는 알레르기 및 전염병 국립 연구소의 협력 계약 상 AI075565 (DAH)로 의해 웬디와 소아 비뇨기과 연구의 우수 켄 루비 기금에 의해 지원되었다. BMC는 주디스와 소아 비뇨기과 로버트 윈스턴 의자입니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. |
References
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