Bacteriana Detecção e Identificação Utilizando sensores eletroquímicos

Summary

Descreve-se um método de ensaio de sensor electroquímico para a detecção bacteriana rápida e identificação. O ensaio envolve uma matriz de sensores funcionalizada com as sondas de DNA para o RNA de captura de oligonucleótidos (rRNA) sequências específicas das espécies ribossomal. Sandwich de rRNA alvo de hibridação com a sonda de captura e uma sonda detectora de peroxidase de rábano ligada ao oligonucleótido de DNA produz uma corrente mensurável amperométrica.

Abstract

Os sensores electroquímicos são amplamente usados ​​para a medição rápida e precisa da glucose sanguínea e pode ser adaptado para a detecção de uma ampla variedade de analitos. Sensores eletroquímicos operam por transdução de um evento de reconhecimento biológico em um sinal elétrico útil. A transdução do sinal ocorre por acoplamento a actividade de uma enzima de redox a um eléctrodo amperométrico. Especificidade do sensor ou é uma característica inerente da enzima, oxidase de glucose, no caso de um sensor de glicose, ou um produto de ligação entre a enzima e um anticorpo ou sonda.

Aqui, descrevemos um método de ensaio sensor eletroquímico para detectar diretamente e identificar bactérias. Em todos os casos, as sondas aqui descritas são oligonucleótidos de ADN. Este método é baseado na hibridização sanduíche de captura e detector sondas com alvo ribossomal RNA (rRNA). A sonda de captura é ancorada à superfície do sensor, enquanto que a sonda é ligada ao detector de horseradish peroxidase (HRP). Quando um substrato, tal como 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) é adicionada a um eléctrodo com complexos de captura-alvo de detectores ligados à sua superfície, o substrato é oxidado por HRP e reduzido pelo eléctrodo de trabalho. Este ciclo redox resultados em vaivém de elétrons pelo substrato do eletrodo para HRP, produzindo o fluxo de corrente no eletrodo.

Introduction

Usando rRNA como uma molécula alvo para a detecção e identificação de bactérias tem um número de vantagens. A abundância de rRNA em células bacterianas estabelece um limite de sensibilidade tão baixo como 250 bactérias por mililitro, sem a necessidade de amplificação de ^um alvo. RRNA bacteriano contém seqüências específicas de espécies únicas que são acessíveis a hibridização com sondas de DNA. Consequentemente, uma série de sensores electroquímicos podem ser usadas para identificar as bactérias desconhecidos, em que cada sensor é funcionalizada com uma sonda de captura específica da espécie diferente. Sensores de controlo positivo deve ser incluído para um alvo oligonucleotídeo sintético que "pontes" a captura e sondas de detecção para criar um sinal de calibração interno.

Os sensores electroquímicos têm uma ampla gama de aplicações de pesquisa básica e translacional. Por exemplo, o ensaio aqui descrito foi usado para medir com precisão o efeito da E. coli em fase de crescimento RRNA e números de cópias pré-rRNA, que é de grande interesse para pesquisadores interessados ​​em fisiologia bacteriana ^2. A sensibilidade do ensaio sensor electroquímico é determinado pela relação sinal-ruído. Uma variedade de métodos de amplificação de sinal e de redução do ruído ter sido explorado. Descobrimos que a melhoria da química da superfície do sensor é essencial para reduzir a ligação não específica da sonda detectora e / ou enzima HRP. Em particular, numa monocamada mista de alkanedithiols e mercaptohexanol foi encontrada para reduzir o fundo, cobrindo a superfície do eléctrodo de forma mais completa, mantendo a acessibilidade da sonda de captura para a hibridação alvo ^3. Estes tratamentos químicos de superfície, são particularmente importantes para os ensaios em amostras biológicas complexas.

Protocol

1. Funcionalização de sensores eletroquímicos Prepare a sonda de captura tiolada a uma concentração de 0,05 mM em 300 mM de 1,6-hexanedithiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 0,3 M, EDTA 1 mM e incubar no escuro à temperatura ambiente durante 10 min . A incubação da sonda de captura tiolado com HDT garante que o grupo tiol na sonda de captura é reduzido, o que resulta em resultados mais consistentes. Aplicar uma corrente de azoto a 16 de chip sensor array nua ouro (s) durante 5 segundos …

Representative Results

Descreve-se um doseamento electroquímico que é estruturado de forma semelhante a uma sanduíche de ELISA. Como mostrado na Figura 1, a hibridação de ARN alvo ribossomal (ARNr), com as sondas de captura e detector é desenvolvido por uma reacção redox catalisada por HRP conjugado com fragmentos de anticorpo anti-fluoresceína que se ligam à extremidade 3 'de fluoresceína de ligação na sonda do detector. Um componente importante da sensibilidade do ensaio é a química da superfície do elé…

Discussion

O ensaio sensor electroquímico aqui descritos permite uma rápida detecção de alvos de ácido nucleico. Sensibilidade e especificidade dependerá em parte da energia livre de hibridização sonda-alvo, o que por sua vez depende do comprimento e do teor de GC de captura e as sondas de detecção. Normalmente, efectuar os passos de hibridação à temperatura ambiente (~ 20 ° C), ^{5, 6.} No entanto, os passos de hibridação (3.2 e 3.3) também pode ser realizada a temperaturas elevadas num forno de hibridaç…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
6-mercapto-1-hexanol (MCH)	Sigma	451088	Store at room temperature
1,6-hexanedithiol (HDT)	Sigma	H-12005	Store at room temperature
Thiolated capture probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Fluorescein-modified detector probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Bridging Oligonucleotide	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments	Roche	11 426 346 910	Store at 4 °C
Helios Chip Reader	GeneFluidics	GFR-2009
Sensor Chip Mount	GeneFluidics	GFR-003
Film well sticker	GeneFluidics		Shipped with sensor chips
Bare gold 16-sensor array chips	GeneFluidics	SC1000-16X-B	Store in 100% N2 at room temperature
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906	Store at 4 °C
1M Phosphate Buffer, pH 7.2			0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2
Blocker Casein in PBS	Pierce	37528	Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C
			Table 1. Reagents and Equipment.