Elektrokimyasal Sensörler kullanarak Bakteriyel Algılama ve Tanıma
Summary
Biz hızlı bakteri bulunması ve belirlenmesi için bir elektrokimyasal sensör test yöntem açıklanmaktadır. Tahlil, ribozomal RNA (rRNA) türe özgü dizileri için DNA oligonükleotid probları yakalama fonksiyonuna sahip bir sensör dizisi içerir. Yakalama prob ve yaban turpu peroksidaz bağlı DNA oligonükleotid dedektör prob ile hedef rRNA Sandwich melezleme ölçülebilir bir amperometrik akım üretir.
Abstract
Elektro kimyasal sensörler yaygın olarak kan şekeri hızlı ve doğru bir ölçüm için kullanılan ve bir analitler çeşitli saptanması için adapte edilebilir. Elektrokimyasal sensörler yararlı bir elektrik sinyali bir biyolojik tanıma olay iletici çalışır. Sinyal transdüksiyonu bir amperometrik elektrot bir biçimde bir redoks enzim aktivitesi bağlanmasıyla gerçekleşir. Sensör özgüllük doğal bir enzimin özelliği, bir glikoz sensörü durumunda glukoz oksidaz veya enzim ve bir antikor veya prob arasındaki bağlantı bir ürün ya da bir.
Burada, doğrudan tespit etmek ve bakteri belirlemek için bir elektrokimyasal sensör test yöntem açıklanmaktadır. Her durumda, burada tarif edilen sondalar DNA oligonükleotitleri vardır. Bu yöntem, hedef RNA (rRNA) ile yakalama ve dedektör probları sandviç hibridizasyona dayanır. Dedektör prob saat bağlı iken yakalama prob, sensör yüzeyine tutturulduğuorseradish peroksidaz (HRP). Örneğin 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) gibi bir alt-tabaka yüzeyine bağlı yakalama hedef dedektörlü kompleksleri ile bir elektrot ilave edildiğinde, alt tabaka, HRP ile oksitlenir ve çalışan elektrot ile azaltılır. Elektrot akım üreten elektrottan HRP alt tabaka ile elektronların mekik Bu redoks döngüsü ile sonuçlanır.
Introduction
Bakteriyel saptanması ve tanımlanması için bir hedef molekülü olarak rRNA kullanılması bir takım avantajları bulunmaktadır. Bakteriyel hücrelerde rRNA bolluğu hedef amplifikasyon 1 için gerek kalmadan mililitre başına 250 bakteri gibi düşük bir duyarlılık sınırı için içerir. Bakteriyel rRNA DNA probları ile hibridizasyon için erişilebilir benzersiz türe özgü dizileri içerir. Sonuç olarak, elektrokimyasal sensör dizisi her bir sensör farklı bir türe spesifik yakalama prob ile işlevlendirilmektedir bilinmeyen bir bakteri, tespit etmek için kullanılabilir. Pozitif kontrol sensörleri "köprü" yakalama ve dedektör probları dahili kalibrasyon sinyali oluşturmak için bir sentetik oligonükleotid hedef için dahil edilmelidir.
Elektrokimyasal sensörler temel ve yorumsal araştırmalar geniş bir uygulama yelpazesi var. Örneğin, tahlil, tam E. etkisini ölçmek için burada açıklanan kullanılmıştır rrn üzerinde coli büyüme aşamasındaBakteriyel fizyolojisi 2 ile ilgilenen araştırmacılara büyük ilgi olan A ve ön rRNA kopya sayıları,. Elektrokimyasal sensör tahlilin hassasiyetini gürültü oranı sinyal ile belirlenir. Sinyal güçlendirme ve gürültü azaltma yöntemleri çeşitli araştırılmıştır. Biz sensör yüzeyinin kimyası geliştirmek dedektör prob ve / veya HRP enzimin spesifik olmayan bağlanma azaltmak için önemli olduğunu bulmak. Özellikle, alkanedithiols ve mercaptohexanol oluşan karışık bir hedef tek tabaka melezleştirme 3 için yakalama probunun yönelik koruyarak daha tam olarak elektrot yüzeyi kapsayan arka planı azaltmak için tespit edilmiştir. Bu yüzey kimyası tedaviler karmaşık biyolojik örnekler içeren deneyleri için özellikle önemlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan elektrokimyasal sensör tahlilinde nükleik asit hedef hızlı tespit sağlar. Duyarlılık ve özgüllük da uzunluğu ve yakalama ve dedektör probları GC içeriğine bağlıdır hedef prob hibridizasyon, serbest enerji kısmen bağlıdır. Biz, tipik olarak ortam sıcaklığında (~ 20 ° C) 5, 6, hibridizasyon adımları. Bununla birlikte, melezleme adımları (3.2 ve 3.3) da chip içeren kapalı bir odaya yerleştirilir ise, bir hibridizasyon fırın içinde daha yüksek bir sıcaklı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Enstitüsü'nden İşbirliği Anlaşması Ödülü AI075565 (DAH için) tarafından ve Wendy ve Pediatrik Üroloji Araştırma Mükemmellik Ken Ruby Fonu tarafından desteklenmiştir. BMC Judith ve Çocuk Ürolojisi Robert Winston başkanıdır.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. |
References
- Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
- Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, (2012).
- Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
- Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
- Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
- Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
- Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
- Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
- Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
- Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
- Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
- Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).
