使用电化学传感器的细菌检测和鉴定
Summary
我们描述了一种电化学传感器的测定方法，细菌的快速检测和识别。的测定法涉及官能化的传感器阵列与DNA的核糖体RNA（rRNA基因）的种属特异性序列的寡核苷酸捕捉探针。目标rRNA基因的捕获探针和辣根过氧化物酶相连的DNA寡核苷酸检测探针的夹心杂交产生可测量的安培电流。
Abstract
电化学传感器被广泛用于快速，准确地测量血糖，并能适用于各种各样的分析物的检测。电化学传感器操作成一个有用的电信号传导生物识别事件。信号转导的发生了耦合到安培的电极的氧化还原酶的活性。传感器的特异性，使用固有特性的酶，葡萄糖氧化酶的葡萄糖传感器的情况下，或的酶和抗体，该抗体或探针之间的关系的商品。
在这里，我们描述的电化学传感器检测方法直接探测和识别细菌。在每一种情况下，这里所描述的探针DNA的寡核苷酸。此方法是基于夹心杂交的捕获和检测探针与目标的核糖体RNA（rRNA基因）。捕获探针被固定到所述传感器表面，而检测器的探头与步骤horseradish过氧化物酶（HRP）。当基片，例如3,3'，5,5' – 四甲基联苯胺（TMB）被添加到绑定到其表面上的复合物与捕捉目标检测器的电极被氧化，在基板由HRP减少工作电极。此氧化还原循环的结果是穿梭的电子从电极到辣根过氧化物酶的底物，生产电极中电流的流动。
Introduction
使用rRNA基因作为目标分子的细菌检测和鉴定了许多优点。 rRNA基因在细菌细胞中的丰度低至每毫升250个细菌提供了一个灵敏度极限，而不需要对目标扩增1。包含独特的物种特异性细菌rRNA基因序列与DNA探针杂交。因此，电化学传感器的阵列可用于识别未知的细菌，其中每个传感器与不同的种属特异性捕获探针官能。应积极控制传感器包括合成的寡核苷酸的目标，“小桥流水”的捕获和检测探针，建立内部校准信号。
电化学传感器有着广泛的基础和转化研究中的应用。例如，这里所描述的测定法被用于精确测量大肠杆菌的效果大肠杆菌生长阶段RRNA和预rRNA基因的拷贝数，这是极大的兴趣，感兴趣的研究人员在细菌生理学2。电化学传感器测定的灵敏度确定的信号噪声比。已探索各种信号放大和降噪方法。我们发现，改善传感器的表面的化学性质，以减少检测器的探头和/或HRP酶的非特异性结合是关键的。混合单层的alkanedithiols mercaptohexanol特别是，已经发现，以减少背景更完全地覆盖在电极表面，同时保持可访问性的捕获探针的目标杂交3。在这些表面化学处理涉及复杂生物样品的分析是特别重要的。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的电化学传感器测定使靶核酸的快速检测。的敏感性和特异性取决于靶 – 探针杂交的自由能，而这又取决于捕获和检测器探针的长度和GC含量的一部分。我们通常执行的的杂交步骤在环境温度（约20℃）5，6。然而，在杂交步骤（3.2和3.3）也可以在杂交烘箱中在较高温度下进行，如果芯片被放置在有盖的腔室，其中包含湿润滤纸，以防止蒸发7，8。获得最佳的信号与检测器?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
支持这项研究是由国家过敏和传染病研究所的合作协议奖AI075565（DAH）和温迪和肯红宝石基金在小儿泌尿外科研究卓越。 BMC是在小儿泌尿外科Judith和主席罗伯特·温斯顿。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. |
References
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