Vi beskriver en elektrokemisk sensor analysemetode for hurtig påvisning af bakterier og identifikation. Assayet involverer et sensorarray funktionaliseret med DNA oligonucleotid capture prober til ribosomale RNA (rRNA) artsspecifikke sekvenser. Sandwich hybridisering af mål-rRNA med indfangningsproben og en peberrodsperoxidase-bundet DNA-oligonukleotid detektorprobe frembringer en målelig amperometrisk strøm.
Elektrokemiske sensorer er almindeligt brugt til hurtig og præcis måling af blodsukker og kan tilpasses til påvisning af en lang række analytter. Elektrokemiske sensorer virker ved at transducere et biologisk anerkendelse begivenhed til et nyttigt elektrisk signal. Signaltransduktion forekommer ved kobling af aktiviteten af en redox-enzym til en amperometrisk elektrode. Sensor specificitet er enten en iboende egenskab af enzymet glucoseoxidase i tilfælde af en glukosesensor, eller et produkt af binding mellem enzymet og et antistof eller proben.
Her beskriver vi en elektrokemisk sensor analysemetode til direkte detektere og identificere bakterier. I hvert tilfælde er proberne beskrevet her DNA-oligonukleotider. Denne metode er baseret på sandwich-hybridisering af opsamling og detektor sonder med target ribosomale RNA (rRNA). Opfangningsproben er forankret til sensoroverfladen, mens detektorproben er knyttet til horseradish peroxidase (HRP). Når et substrat, såsom 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) sættes til en elektrode med capture-target-detektor komplekser bundet til sin overflade er substratet oxideres af HRP og reduceret med arbejdselektroden. Denne redox cyklus medfører shuttling af elektroner fra substratet fra elektroden til HRP, der producerer strøm i elektroden.
Brug rRNA som en målmolekyle til bakteriel detektion og identifikation har en række fordele. Den overflod af rRNA i bakterieceller giver en følsomhed grænse så lav som 250 bakterier per milliliter uden behov for målamplifikation 1.. Bakteriel rRNA indeholder unikke arter-specifikke sekvenser, der er tilgængelige for hybridisering med DNA-prober. Følgelig kan et array af elektrokemiske sensorer anvendes til at identificere ukendte bakterier, hvor hver sensor er funktionaliseret med en anden arts-specifik opfangningsprobe. Positive Sensorer bør medtages for et syntetisk oligonukleotid mål om, at "broer" til opsamling og detektorprober at skabe et indre kalibrering signal.
Elektrokemiske sensorer har en bred vifte af grundlæggende og translationel forskning applikationer. For eksempel som beskrevet assayet her er blevet anvendt til præcist at måle effekten af E. coli vækstfase på rrnA og præ-rRNA kopiantal, som er af stor interesse for forskere interesseret i bakteriel fysiologi 2.. Følsomheden af den elektrokemiske sensor assayet bestemmes af signal-støj-forholdet. En række af signalforstærkning og støjreduktion metoder er blevet udforsket. Vi finder, at en forbedring af kemien i sensorens overflade er nøglen til at reducere ikke-specifik binding af detektorprobe og / eller HRP enzym. Navnlig har en blandet monolag af alkanedithiols og mercaptohexanol vist sig at reducere baggrund ved at dække elektroden overflade mere fuldstændigt samtidig bevare tilgængeligheden af indfangningsproben til target-hybridisering 3.. Disse overfladekemien behandlinger er særligt vigtige for analyser, der involverer komplekse biologiske prøver.
Den elektrokemiske sensor assay beskrevet her muliggør hurtig påvisning af nukleinsyremål. Sensitivitet og specificitet til dels afhænge af den frie energi for target-probehybridisering, hvilket igen afhænger af længden og GC indhold opsamling og detektorprober. Vi udfører typisk hybridiseringstrin ved stuetemperatur (~ 20 ° C) 5, 6. Dog kan hybridiseringstrin (3.2 og 3.3) også udføres ved højere temperaturer i en hybridisering ovnen, hvis chippen er placeret i en overdækket kammer indeholdende fu…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af Cooperative aftale Award AI075565 (til DAH) fra National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme samt af Wendy og Ken Ruby Fund for Excellence i Pediatric Urology Research. BMC er Judith og Robert Winston Chair i Pediatric Urology.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
Table 1. Reagents and Equipment. |