Bacterial Detection & identification au moyen de capteurs électrochimiques
Summary
Nous décrirons une méthode de dosage du capteur électrochimique pour la détection rapide de bactéries et d'identification. L'essai comporte une matrice de capteurs fonctionnalisé avec de l'ADN d'oligonucléotides sondes de capture pour des séquences spécifiques d'espèces d'ARN ribosomique (ARNr). Sandwich hybridation de l'ARNr cible avec la sonde de capture et une sonde de détection d'oligonucléotides d'ADN lié à la peroxydase de raifort produit un courant ampérométrique mesurable.
Abstract
Les capteurs électrochimiques sont largement utilisés pour la mesure rapide et précise de glucose dans le sang et peuvent être adaptés à la détection d'une large variété d'analytes. Les capteurs électrochimiques fonctionnent par transduction d'un événement de reconnaissance biologique en un signal électrique utile. La transduction de signal se produit par couplage de l'activité d'une enzyme d'oxydo-réduction pour une électrode ampérométrique. spécificité du capteur est soit une caractéristique inhérente de l'enzyme, la glucose-oxydase dans le cas d'un capteur de glucose, ou un produit de couplage entre l'enzyme et un anticorps ou une sonde.
Ici, nous décrivons une méthode de dosage du capteur électrochimique pour détecter directement et identifier les bactéries. Dans tous les cas, les sondes décrites ici sont des oligonucléotides d'ADN. Cette méthode est basée sur hybridation sandwich de capture et de détection des sondes avec cible ARN ribosomal (ARNr). La sonde de capture est fixée à la surface du capteur, tandis que la sonde de détection est lié à horseradish peroxydase (HRP). Quand un substrat tel que le 3,3 ', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) est ajouté à une électrode avec des complexes de capture-cible-détecteur lié à sa surface, le substrat est oxydée par le HRP et réduit par l'électrode de travail. Cette redox cycle conduit à la navette d'électrons par le substrat de l'électrode à la HRP, produisant le flux de courant dans l'électrode.
Introduction
Utiliser ARNr comme une molécule cible pour la détection et l'identification bactérienne a un certain nombre d'avantages. L'abondance de l'ARNr dans les cellules bactériennes prévoit une limite de sensibilité aussi bas que 250 bactéries par millilitre, sans la nécessité d'amplification de la cible 1. ARNr bactérien contient des séquences spécifiques d'espèces uniques qui sont accessibles à l'hybridation avec des sondes d'ADN. En conséquence, un ensemble de capteurs électrochimiques peut être utilisée pour identifier des bactéries inconnues, où chaque capteur est fonctionnalisé avec une sonde de capture spécifique d'espèce différente. Capteurs de contrôle positifs doivent être inclus pour une cible d'oligonucléotides synthétiques qui «ponts» de la capture et des sondes de détection pour créer un signal de calibrage interne.
Les capteurs électrochimiques ont une large gamme d'applications de recherche fondamentale et translationnelle. Par exemple, le dosage décrit ici a été utilisé pour mesurer précisément l'effet de E. phase de croissance coli sur les RRNA et le nombre de copies pré-ARNr, qui est d'un grand intérêt pour les chercheurs qui s'intéressent à la physiologie bactérienne 2. La sensibilité du test de détection électrochimique est déterminé par le rapport signal sur bruit. Une variété d'amplification du signal et des méthodes de réduction du bruit ont été explorées. Nous constatons que l'amélioration de la chimie de la surface du capteur est essentielle pour réduire la liaison non spécifique de la sonde de détection et / ou enzyme HRP. En particulier, une monocouche mixte de alkanedithiols et mercaptohexanol a été trouvée pour réduire le fond, en recouvrant la surface de l'électrode plus complètement, tout en conservant l'accessibilité de la sonde de capture pour l'hybridation de la cible 3. Ces traitements chimiques de surface sont particulièrement importants pour les essais portant sur des échantillons biologiques complexes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le test de détection électrochimique décrite ici permet la détection rapide de cibles d'acides nucléiques. La sensibilité et la spécificité dépendent en partie de l'énergie libre de l'hybridation cible-sonde, qui à son tour dépend de la longueur et la teneur en GC de la capture et sondes de détection. Nous effectuons généralement les étapes d'hybridation à température ambiante (~ 20 ° C) 5, 6. Toutefois, les étapes d'hybridation (3.2 et 3.3) peuvent également être eff…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par l'accord de coopération Award AI075565 (à DAH) de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses et par le Fonds Wendy et Ruby Ken pour l'excellence en urologie pédiatrique recherche. BMC est le Judith et président Robert Winston en urologie pédiatrique.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. |
References
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