विद्युत सेंसर का उपयोग बैक्टीरिया का पता लगाने और पहचान
Summary
हम तेजी से बैक्टीरिया का पता लगाने और पहचान के लिए एक विद्युत सेंसर परख विधि का वर्णन है. परख ribosomal शाही सेना (rRNA) प्रजाति विशेष दृश्यों के लिए डीएनए oligonucleotide कब्जा जांच के साथ क्रियाशील एक संवेदक सरणी शामिल है. कब्जा जांच और एक हॉर्सरैडिश peroxidase से जुड़ी डीएनए oligonucleotide डिटेक्टर जांच के साथ लक्ष्य rRNA की सैंडविच संकरण एक औसत दर्जे का amperometric वर्तमान उत्पादन करता है.
Abstract
विद्युत सेंसर व्यापक रूप से रक्त शर्करा का तेजी से और सही माप के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं और analytes की एक विस्तृत विविधता का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. विद्युत सेंसर एक उपयोगी बिजली के संकेत में एक जैविक मान्यता घटना transducing द्वारा संचालित. संकेत पारगमन एक amperometric इलेक्ट्रोड के लिए एक redox एंजाइम की गतिविधि युग्मन के द्वारा होता है. सेंसर विशिष्टता एक अंतर्निहित एंजाइम की विशेषता, एक ग्लूकोज सेंसर के मामले में ग्लूकोज oxidase, या एंजाइम और एक एंटीबॉडी या जांच के बीच संबंध का एक उत्पाद या तो है.
यहाँ, हम सीधे पता लगाने और बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए एक विद्युत सेंसर परख विधि का वर्णन है. हर मामले में, यहाँ वर्णित जांच डीएनए oligonucleotides हैं. इस पद्धति का लक्ष्य ribosomal शाही सेना (rRNA) के साथ पकड़ने और डिटेक्टर जांच के सैंडविच संकरण पर आधारित है. डिटेक्टर जांच ज से जुड़ा हुआ है, जबकि कब्जा जांच, सेंसर सतह पर लंगर डाले हैorseradish peroxidase (एचआरपी). ऐसे 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) के रूप में एक सब्सट्रेट इसकी सतह के लिए बाध्य कब्जा लक्ष्य डिटेक्टर परिसरों के साथ एक इलेक्ट्रोड के लिए जोड़ा जाता है, सब्सट्रेट एचआरपी द्वारा ऑक्सीकरण और काम कर इलेक्ट्रोड से कम है. इलेक्ट्रोड में वर्तमान प्रवाह उत्पादन, इलेक्ट्रोड से एचआरपी के लिए सब्सट्रेट द्वारा इलेक्ट्रॉनों के चक्कर में यह रेडोक्स चक्र का परिणाम है.
Introduction
बैक्टीरिया का पता लगाने और पहचान के लिए एक लक्ष्य अणु के रूप में rRNA का उपयोग कर लाभ का एक नंबर है. बैक्टीरियल कोशिकाओं में rRNA की बहुतायत लक्ष्य प्रवर्धन 1 के लिए आवश्यकता के बिना मिली लीटर प्रति 250 बैक्टीरिया के रूप में कम के रूप में एक संवेदनशीलता सीमा का प्रावधान है. बैक्टीरियल rRNA डीएनए जांच के साथ संकरण करने के लिए पहुंच रहे हैं कि अद्वितीय प्रजाति विशेष दृश्यों में शामिल है. नतीजतन, विद्युत सेंसर की एक सरणी के प्रत्येक संवेदक एक अलग प्रजाति विशेष कब्जा जांच के साथ क्रियाशील है जहां अज्ञात बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सकारात्मक नियंत्रण सेंसर "पुल" पर कब्जा और डिटेक्टर जांच एक आंतरिक अंशांकन संकेत बनाने के लिए एक कृत्रिम oligonucleotide लक्ष्य के लिए शामिल किया जाना चाहिए.
विद्युत सेंसर बुनियादी और translational अनुसंधान आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला है. उदाहरण के लिए, परख ठीक ई. के प्रभाव को मापने के लिए यहाँ वर्णित इस्तेमाल किया गया है rRN पर कोलाई विकास के चरणबैक्टीरियल फिजियोलॉजी 2 में रुचि शोधकर्ताओं के लिए महान ब्याज की है जो एक और पूर्व rRNA प्रतिलिपि संख्या,. विद्युत सेंसर परख की संवेदनशीलता शोर अनुपात करने के लिए संकेत द्वारा निर्धारित किया जाता है. संकेत प्रवर्धन और शोर कम करने के तरीकों की एक किस्म का पता लगाया गया है. हम सेंसर सतह के रसायन शास्त्र में सुधार डिटेक्टर जांच और / या एचआरपी एंजाइम की अविशिष्ट बंधन को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है कि लगता है. विशेष रूप से, alkanedithiols और mercaptohexanol की एक मिश्रित monolayer के लक्ष्य संकरण 3 के लिए कब्जा जांच की पहुंच बनाए रखते हुए और पूरी तरह से इलेक्ट्रोड सतह को कवर द्वारा पृष्ठभूमि कम पाया गया है. ये रसायन शास्त्र की सतह उपचार जटिल जैविक नमूनों को शामिल assays के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित विद्युत सेंसर परख न्यूक्लिक एसिड लक्ष्य का तेजी से पता लगाने में सक्षम बनाता है. संवेदनशीलता और विशिष्टता के बदले में लंबाई और कब्जा और डिटेक्टर जांच के जीसी सामग्री पर निर्भर करता है जो ल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान से सहकारी समझौते पुरस्कार AI075565 (दाह करने के लिए) से और वेंडी और बाल चिकित्सा मूत्रविज्ञान अनुसंधान में उत्कृष्टता के लिए केन रूबी कोष द्वारा समर्थित किया गया था. बीएमसी जूडिथ और बाल चिकित्सा मूत्रविज्ञान में रॉबर्ट विंस्टन अध्यक्ष है.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. |
References
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