Rilevamento e identificazione batterica Utilizzando Sensori elettrochimici
Summary
Descriviamo un metodo di analisi sensore elettrochimico per la rilevazione rapida di batteri e di identificazione. Il saggio comporta una serie di sensori funzionalizzato con DNA oligonucleotide sonde di cattura per RNA ribosomiale (rRNA) sequenze specie-specifici. Sandwich ibridazione del target rRNA con la sonda di cattura e di una perossidasi-coniugati DNA sonda rivelatore oligonucleotide rafano produce una corrente amperometrico misurabile.
Abstract
Sensori elettrochimici sono ampiamente utilizzati per la misurazione rapida e accurata del glucosio nel sangue e possono essere adattati per il rilevamento di una grande varietà di analiti. Sensori elettrochimici operano trasducendo un evento di riconoscimento biologico in un segnale elettrico utile. Trasduzione del segnale avviene accoppiando l'attività di un enzima redox a un elettrodo amperometrico. Sensore specificità è o una caratteristica inerente l'enzima, glucosio ossidasi nel caso di un sensore di glucosio, o un prodotto di legame tra l'enzima ed un anticorpo o sonda.
Qui, descriviamo un metodo di saggio sensore elettrochimico per rilevare direttamente e identificare i batteri. In ogni caso, le sonde descritte qui sono oligonucleotidi di DNA. Questo metodo si basa sul panino ibridazione di catturare ed identificare sonde con bersaglio RNA ribosomiale (rRNA). La sonda di cattura è ancorata alla superficie del sensore, mentre la sonda rivelatore è legata horseradish perossidasi (HRP). Quando un substrato quale 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) è aggiunto ad un elettrodo con complessi di cattura-target-rivelatore legati alla sua superficie, il substrato viene ossidato da HRP e ridotto l'elettrodo di lavoro. Questo redox ciclo sono presenti spola di elettroni da parte del substrato dall'elettrodo a HRP, producendo flusso di corrente nel dell'elettrodo.
Introduction
Usando rRNA come molecola bersaglio per il rilevamento e l'identificazione batterica ha una serie di vantaggi. L'abbondanza di rRNA in cellule batteriche prevede un limite di sensibilità a partire da 250 batteri per ml senza la necessità di amplificazione del target 1. RRNA batterico contiene uniche sequenze specie-specifici che sono accessibili a ibridazione con sonde di DNA. Di conseguenza, un array di sensori elettrochimici può essere utilizzato per identificare batteri sconosciuti, dove ogni sensore è funzionalizzato con un diverso sonda di cattura specie-specifica. Sensori di controlli positivi devono essere inclusi per un target oligonucleotide sintetico che "ponti" la cattura e sonde rivelatore per creare un segnale di calibrazione interno.
Sensori elettrochimici hanno una vasta gamma di applicazioni di ricerca di base e traslazionale. Per esempio, il saggio qui descritto è stato usato per misurare con precisione l'effetto di E. coli fase di crescita su RRNA e numero di copie pre-rRNA, che è di grande interesse per i ricercatori interessati alla fisiologia dei batteri 2. La sensibilità del saggio sensore elettrochimico è determinato dal rapporto segnale-rumore. Una varietà di amplificazione del segnale e di metodi di riduzione del rumore sono stati esplorati. Troviamo che migliorando la chimica della superficie del sensore è fondamentale per ridurre il legame non specifico della sonda rivelatore e / o enzima HRP. In particolare, un monostrato misto di alkanedithiols e mercaptohexanol è stato trovato per ridurre sfondo coprendo la superficie dell'elettrodo più completamente mantenendo accessibilità della sonda di cattura per bersaglio ibridazione 3. Questi trattamenti chimici superficiali sono particolarmente importanti per saggi con campioni biologici complessi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il test del sensore elettrochimico qui descritto consente una rapida individuazione di obiettivi di acidi nucleici. Sensibilità e specificità dipendono in parte l'energia libera di ibridazione sonda-bersaglio, che a sua volta dipende dalla lunghezza e il contenuto di GC della cattura e sonde rivelatore. Noi di solito eseguire i passaggi di ibridazione a temperatura ambiente (~ 20 ° C) 5, 6. Tuttavia, la procedura di ibridazione (3.2 e 3.3) possono essere eseguite anche a temperature più elevate in un …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da Cooperativa accordo Award AI075565 (a DAH) presso l'Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive e da Wendy e Ken Fondo Rubino per l'Eccellenza in Pediatric Urology Research. BMC è la Giuditta e Robert Winston Cattedra di Urologia Pediatrica.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. |
References
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