Бактериальные обнаружения и идентификации с использованием электрохимических датчиков
Summary
Мы описываем анализ электрохимических датчиков метод для быстрого бактериального обнаружения и идентификации. Анализ включает в себя датчик массива функционализированы олигонуклеотида захвата зондов для рибосомной РНК (рРНК) видоспецифической последовательностей. Сэндвич-гибридизации целевых рРНК с зондом захвата и пероксидазой хрена олигонуклеотида, детектор зонд производит измеримые амперометрического тока.
Abstract
Электрохимические датчики широко используются для быстрого и точного измерения уровня глюкозы в крови и может быть адаптирована для обнаружения широкого спектра анализируемых веществ. Электрохимические датчики работают по трансдукции биологических распознавание событий в полезный электрический сигнал. Передача сигнала происходит путем соединения активность окислительно-восстановительных ферментов для амперометрического электрода. Датчик специфичность либо неотъемлемой характеристикой ферментов глюкозооксидазы в случае сенсор глюкозы, или продукт связь между ферментом и антитела или зонда.
Здесь мы описываем анализа электрохимического датчика метод непосредственного обнаружения и идентификации бактерий. В любом случае, зонды, описанные здесь, представляют собой ДНК-олигонуклеотидов. Этот метод основан на гибридизации сэндвич захвата и датчики пламени с целевыми рибосомной РНК (рРНК). Захват зонда прикреплен к поверхности датчика, а детектор зонд связан с чorseradish пероксидазы (HRP). Когда субстрат, такой как 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) в электроде с захватом-мишень-детектор комплексы, связанные с его поверхности, субстрат окисляется пероксидазой хрена, и уменьшается на рабочем электроде. Этот результат окислительно-восстановительного цикла в челночные электронов на подложке из электрода для HRP, производя тока в электроде.
Introduction
Использование рРНК в качестве молекулы-мишени для бактериальной обнаружения и идентификации имеет ряд преимуществ. Обилие рРНК в бактериальных клетках предусматривает предел чувствительности по цене от 250 бактерий на миллилитр без необходимости целевого усиления 1. Бактериальные рРНК содержит уникальный видоспецифических последовательностей, которые являются доступными для гибридизации с ДНК-зондами. Следовательно, множество электрохимических датчиков может быть использована для идентификации неизвестных бактерии, где каждый датчик функционализированных различных видов конкретного захвата зонда. Положительный контроль датчики должны быть включены в синтетический олигонуклеотид, который мишень "мостов" захват и детектор зондов создать внутренний сигнал калибровки.
Электрохимические датчики имеют широкий спектр основных и поступательного исследовательских задач. Например, анализ, описанный здесь был использован, чтобы точно измерить эффект E. кишечной фазе роста на RRNИ пре-рРНК числом копий, что представляет большой интерес для исследователей, заинтересованных в бактериальной физиологии 2. Чувствительность анализа электрохимического датчика определяется отношение сигнал-шум. Разнообразие усиления сигнала и методы шумоподавления были изучены. Мы считаем, что улучшение химии поверхности датчика является ключом к сокращению неспецифическое связывание зонда детектора и / или HRP фермента. В частности, смешанного монослоя alkanedithiols и mercaptohexanol было установлено, уменьшить фон путем покрытия поверхности электрода более полно, сохраняя при этом доступность захватывающего зонда для гибридизации мишень 3. Эти процедуры химии поверхности особенно важны для анализа с участием сложных биологических образцов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ электрохимический сенсор описанный здесь позволяет быстрое обнаружение нуклеиновых кислот-мишеней. Чувствительность и специфичность зависеть частично от свободной энергии мишень-гибридизации с зондом, который, в свою очередь, зависит от длины и GC содержание захвата и детекто…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Совместная премия AI075565 Соглашения (в ПРЗ) из Национального института аллергии и инфекционных заболеваний и Венди и Кен Рубин фонда за высокое качество исследований в области педиатрии в урологии. BMC является Джудит и Роберт Уинстон кафедра детской урологии.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. |
References
- Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
- Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, (2012).
- Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
- Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
- Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
- Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
- Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
- Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
- Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
- Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
- Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
- Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).
