Bacterial Detección e Identificación Usando sensores electroquímicos
Summary
Se describe un método de ensayo sensor electroquímico para la detección e identificación bacteriana rápida. El ensayo implica una serie de sensores funcionalizado con sondas de captura de oligonucleótidos de ADN para ARN ribosomal (ARNr) secuencias específicas de la especie. Sandwich hibridación de ARNr objetivo con la sonda de captura y una sonda de oligonucleótido detector de ADN unido a peroxidasa de rábano picante produce una corriente amperométrica medible.
Abstract
Los sensores electroquímicos se utilizan ampliamente para una rápida y precisa medición de la glucosa en la sangre y se pueden adaptar para la detección de una amplia variedad de analitos. Los sensores electroquímicos operan por transducción de un evento de reconocimiento biológico en una señal eléctrica útil. La transducción de señales se produce mediante el acoplamiento de la actividad de una enzima redox a un electrodo amperométrico. Especificidad del sensor es ya sea una característica inherente de la enzima, la glucosa oxidasa en el caso de un sensor de glucosa, o un producto de la vinculación entre la enzima y un anticuerpo o sonda.
A continuación, describimos un método de ensayo sensor electroquímico para detectar e identificar bacterias directamente. En todos los casos, las sondas descritas aquí son oligonucleótidos de ADN. Este método se basa en sándwich de hibridación de sondas de captura y el detector con objetivo de ARN ribosómico (ARNr). La sonda de captura está anclado a la superficie del sensor, mientras que la sonda detectora está vinculada a horseradish peroxidasa (HRP). Cuando se añade un sustrato tal como 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) a un electrodo con complejos de captura-meta-detector unidos a su superficie, el sustrato se oxida por el HRP y reduce en el electrodo de trabajo. Este ciclo redox resultados, en el transporte de electrones por el sustrato del electrodo con HRP, producir flujo de corriente en el electrodo.
Introduction
Uso de rRNA como una molécula diana para la detección e identificación bacteriana tiene una serie de ventajas. La abundancia de ARNr en las células bacterianas prevé un límite de sensibilidad tan bajo como 250 bacterias por mililitro y sin la necesidad de amplificación de la diana 1. RRNA bacteriano contiene secuencias únicas especies específicas que son accesibles a la hibridación con sondas de ADN. En consecuencia, una serie de sensores electroquímicos se puede utilizar para identificar las bacterias desconocidos, donde cada sensor está funcionalizado con una sonda de captura específica de la especie diferente. Sensores del control positivo deben ser incluidos para un objetivo oligonucleótido sintético que "puentes" de la captura y las sondas de detección para crear una señal de calibración interna.
Los sensores electroquímicos tienen una amplia gama de aplicaciones de investigación básica y de la traducción. Por ejemplo, el ensayo descrito aquí se ha utilizado para medir con precisión el efecto de la E. coli en fase de crecimiento rrnA y el número de copias pre-rRNA, que es de gran interés para los investigadores interesados en la fisiología bacteriana 2. La sensibilidad del ensayo sensor electroquímico se determina por la relación señal a ruido. Se han explorado una diversidad de amplificación de la señal y los métodos de reducción de ruido. Nosotros encontramos que la mejora de la química de la superficie del sensor es clave para reducir la unión no específica de la sonda detector y / o enzima HRP. En particular, se ha encontrado una monocapa mixta de alkanedithiols y mercaptohexanol para reducir fondo, cubriendo la superficie del electrodo de forma más completa al tiempo que conserva la accesibilidad de la sonda de captura para la hibridación de destino 3. Estos tratamientos química de la superficie son particularmente importantes para los ensayos que implican muestras biológicas complejas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo de sensor electroquímico descrito aquí permite la rápida detección de dianas de ácido nucleico. La sensibilidad y la especificidad dependen en parte de la energía libre de hibridación diana-sonda, que a su vez depende de la longitud y contenido de GC de la captura y sondas detectoras. Normalmente realizamos los pasos de hibridación a temperatura ambiente (~ 20 ° C) 5, 6. Sin embargo, las etapas de hibridación (3.2 y 3.3) también se puede realizar a temperaturas más elevadas en un horno d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la Cooperativa Premio Acuerdo AI075565 (al DAH) del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas y el Wendy y Ken Fondo Rubí a la Excelencia en Investigación Pediátrica Urología. BMC es la Judith y Robert Winston Cátedra de Urología Pediátrica.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. |
References
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