Bakteriel Detection og identifikation Brug elektrokemiske sensorer

Summary

Vi beskriver en elektrokemisk sensor analysemetode for hurtig påvisning af bakterier og identifikation. Assayet involverer et sensorarray funktionaliseret med DNA oligonucleotid capture prober til ribosomale RNA (rRNA) artsspecifikke sekvenser. Sandwich hybridisering af mål-rRNA med indfangningsproben og en peberrodsperoxidase-bundet DNA-oligonukleotid detektorprobe frembringer en målelig amperometrisk strøm.

Abstract

Elektrokemiske sensorer er almindeligt brugt til hurtig og præcis måling af blodsukker og kan tilpasses til påvisning af en lang række analytter. Elektrokemiske sensorer virker ved at transducere et biologisk anerkendelse begivenhed til et nyttigt elektrisk signal. Signaltransduktion forekommer ved kobling af aktiviteten af ​​en redox-enzym til en amperometrisk elektrode. Sensor specificitet er enten en iboende egenskab af enzymet glucoseoxidase i tilfælde af en glukosesensor, eller et produkt af binding mellem enzymet og et antistof eller proben.

Her beskriver vi en elektrokemisk sensor analysemetode til direkte detektere og identificere bakterier. I hvert tilfælde er proberne beskrevet her DNA-oligonukleotider. Denne metode er baseret på sandwich-hybridisering af opsamling og detektor sonder med target ribosomale RNA (rRNA). Opfangningsproben er forankret til sensoroverfladen, mens detektorproben er knyttet til horseradish peroxidase (HRP). Når et substrat, såsom 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) sættes til en elektrode med capture-target-detektor komplekser bundet til sin overflade er substratet oxideres af HRP og reduceret med arbejdselektroden. Denne redox cyklus medfører shuttling af elektroner fra substratet fra elektroden til HRP, der producerer strøm i elektroden.

Introduction

Brug rRNA som en målmolekyle til bakteriel detektion og identifikation har en række fordele. Den overflod af rRNA i bakterieceller giver en følsomhed grænse så lav som 250 bakterier per milliliter uden behov for målamplifikation ^1.. Bakteriel rRNA indeholder unikke arter-specifikke sekvenser, der er tilgængelige for hybridisering med DNA-prober. Følgelig kan et array af elektrokemiske sensorer anvendes til at identificere ukendte bakterier, hvor hver sensor er funktionaliseret med en anden arts-specifik opfangningsprobe. Positive Sensorer bør medtages for et syntetisk oligonukleotid mål om, at "broer" til opsamling og detektorprober at skabe et indre kalibrering signal.

Elektrokemiske sensorer har en bred vifte af grundlæggende og translationel forskning applikationer. For eksempel som beskrevet assayet her er blevet anvendt til præcist at måle effekten af E. coli vækstfase på rrnA og præ-rRNA kopiantal, som er af stor interesse for forskere interesseret i bakteriel fysiologi ^2.. Følsomheden af ​​den elektrokemiske sensor assayet bestemmes af signal-støj-forholdet. En række af signalforstærkning og støjreduktion metoder er blevet udforsket. Vi finder, at en forbedring af kemien i sensorens overflade er nøglen til at reducere ikke-specifik binding af detektorprobe og / eller HRP enzym. Navnlig har en blandet monolag af alkanedithiols og mercaptohexanol vist sig at reducere baggrund ved at dække elektroden overflade mere fuldstændigt samtidig bevare tilgængeligheden af indfangningsproben til target-hybridisering ^3.. Disse overfladekemien behandlinger er særligt vigtige for analyser, der involverer komplekse biologiske prøver.

Protocol

1.. Funktionalisering af elektrokemiske sensorer Forbered thiolerede opfangningsprobe ved en koncentration på 0,05 uM i 300 uM 1,6-hexandithiol (HDT), 10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA og inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 10 min . Inkubation af thiolerede indfangningsproben med HDT sikrer, at thiolgruppe på opfangningsproben er reduceret, hvilket resulterer i mere ensartede resultater. Påfør en strøm af nitrogen til bare guld 16 sensor-chip (r) i 5 sekunder for at fjerne fugt …

Representative Results

Vi beskriver en elektrokemisk analyse, der er struktureret på samme måde som en sandwich-ELISA. Som vist i figur 1, mål ribosomale RNA (rRNA) hybridisering med opsamling og detektor sonder er udviklet af et redox reaktion katalyseret af HRP konjugeret til anti-fluorescein-antistof-fragmenter, der binder til 3'fluorescein binding på detektoren sonden. En vigtig del af analysesensitivitet er overfladen kemi guldelektroden. Vi har fundet, at en ternær monolag bestående af thiolerede indfangningsp…

Discussion

Den elektrokemiske sensor assay beskrevet her muliggør hurtig påvisning af nukleinsyremål. Sensitivitet og specificitet til dels afhænge af den frie energi for target-probehybridisering, hvilket igen afhænger af længden og GC indhold opsamling og detektorprober. Vi udfører typisk hybridiseringstrin ved stuetemperatur (~ 20 ° C) ^{5, 6.} Dog kan hybridiseringstrin (3.2 og 3.3) også udføres ved højere temperaturer i en hybridisering ovnen, hvis chippen er placeret i en overdækket kammer indeholdende fu…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
6-mercapto-1-hexanol (MCH)	Sigma	451088	Store at room temperature
1,6-hexanedithiol (HDT)	Sigma	H-12005	Store at room temperature
Thiolated capture probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Fluorescein-modified detector probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Bridging Oligonucleotide	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments	Roche	11 426 346 910	Store at 4 °C
Helios Chip Reader	GeneFluidics	GFR-2009
Sensor Chip Mount	GeneFluidics	GFR-003
Film well sticker	GeneFluidics		Shipped with sensor chips
Bare gold 16-sensor array chips	GeneFluidics	SC1000-16X-B	Store in 100% N2 at room temperature
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906	Store at 4 °C
1M Phosphate Buffer, pH 7.2			0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2
Blocker Casein in PBS	Pierce	37528	Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C
			Table 1. Reagents and Equipment.