Een kwantitatieve methode voor de analyse van chromosoom replicatie timing beschreven. De werkwijze gebruikt BrdU opname in combinatie met fluorescent<em> In situ</em> Hybridisatie (FISH) de replicatie timing van zoogdier chromosomen beoordelen. Deze techniek maakt de directe vergelijking van herschikte en niet-herschikte chromosomen binnen dezelfde cel.
Zoogdier DNA replicatie start op meerdere plaatsen langs chromosomen op verschillende momenten in S fase na een tijdelijke replicatieprogramma. De specificatie van replicatie timing wordt beschouwd als een dynamisch proces gereguleerd door weefsel-specifieke en ontwikkelingsstoornissen signalen die inspelen op epigenetische modificaties zijn. Echter, de mechanismen tot regeling van waar en wanneer de replicatie van DNA initieert samen chromosomen blijft slecht begrepen. Homologe chromosomen meestal synchroon te repliceren, maar er zijn uitzonderingen op deze regel. Bijvoorbeeld, in vrouwelijke zoogdiercellen een van de twee X-chromosomen wordt late replicerende door een proces dat X inactivatie 1. Samen met deze vertraging in de replicatie timing, geschat op 2-3 uur te zijn, raken de meerderheid van de genen transcriptioneel zwijgen over een X-chromosoom. Bovendien een discrete cis-acting locus, bekend als de X inactivatie centrum regelt deze X inactivatie, inclusief the inductie van vertraagde replicatie timing op de gehele inactieve X-chromosoom. Bovendien zijn bepaalde chromosoomherschikkingen in kankercellen en cellen blootgesteld aan ioniserende straling tonen een aanzienlijke vertraging van replicatie timing> 3 uren beïnvloedt het hele chromosoom 2,3. Recent werk van ons lab geeft aan dat verstoring van discrete cis-werkende autosomale loci resulteren in een zeer laat repliceren fenotype dat het hele chromosoom 4 beïnvloedt. Extra 'chromosoom engineering' studies geven aan dat bepaalde chromosoom herschikkingen van invloed zijn veel verschillende chromosomen resultaat in deze abnormale replicatie-timing fenotype, wat suggereert dat alle zoogdieren chromosomen discrete cis-werkende loci dat een goede replicatie timing van de individuele chromosomen 5 besturen bevatten.
Hier geven we een werkwijze voor de kwantitatieve analyse van chromosoom replicatie timing gecombineerd met fluorescente in situ hybridisatie. Dezewerkwijze maakt een rechtstreekse vergelijking van replicatie timing tussen homologe chromosomen binnen dezelfde cel, en is aangepast van 6. Bovendien maakt deze werkwijze de eenduidige identificatie van chromosomale herschikkingen die correleren met veranderingen in replicatie timing dat het gehele chromosoom beïnvloeden. Deze methode heeft voordelen ten opzichte van recent ontwikkelde high throughput micro-array of sequencing protocollen die geen onderscheid kunnen maken tussen homologe allelen aanwezig zijn op herschikt en niet-herschikt chromosomen. Bovendien, omdat de hier beschreven methode resulteert afzonderlijke cellen kan detecteren veranderingen in chromosoom replicatie timing chromosomale herschikkingen die aanwezig zijn in slechts een fractie van de cellen in een populatie.
De bereiding van chromosoom spreads is een kritische stap voor de succesvolle replicatie-timing assay beschreven. De opname van een Colcemid voorbehandelingsstap vóór de hypotonische behandeling kan helpen bij de frequentie en verspreiding van mitotische cellen. We meestal bloot cellen colcemdi gedurende 1-3 uur vóór de oogst en gebruik Colcemid in een eindconcentratie van 10 ug / ml. Echter, de opneming van een Colcemid voorbehandelingsstap veranderen de lengte van G2 en kunnen derhalve de schijnbare replicatie tim…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het National Cancer Institute, CA131967.
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
Anti-BrdU-FITC | Roche Millipore | 11202593001 MAB326F | 50 μg/μl |
Nick Translation Kit | Abbott Molecular (Vysis) | 07J00-0001 | |
Spectrum Orange dUTP | Abbott Molecular (Vysis) | 02N33-050 | |
CEP | Abbott Molecular (Vysis) | Varies | |
LSI/WCP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 06J67-011 | |
CEP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 07J36-001 | |
Chromosome paints | MetaSystems Group | D-14NN-050-TR | |
Olympus BX61 Fluorescent Microscope | Olympus | BX61TRF-1-5 | |
Microscope imaging software system | Applied Imaging | Cytovision 3.93.1 | |
Digital Camera | Olympus | UCMAD3 | |
IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES 35 ml Formamide* (Sigma) * It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamide (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)] Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots). 0.1 M NaH2P04 , 1 L 13.8 g NaH2P04 (Sigma): 0.1 M NaH2P04 1 L 14.2 g NaH2P04 (Sigma) PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40. PNM 50 ml 1.25 g Non-fat dry milk (Sigma) Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins. |