Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em> Yerinde</em> Hibridizasyon
Summary
Kromozom replikasyonu zamanlama analizi için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem floresan ile kombinasyon halinde BrdU eklenmesi kullanır<em> In situ</em> Memeli kromozom çoğaltma zamanlamasını değerlendirmek için hibridizasyon (FISH). Bu teknik aynı hücre içinde yeniden ve un-yeniden düzenlenmiş kromozomun doğrudan karşılaştırma olanağını sağlamaktadır.
Abstract
Memeli DNA replikasyonu zamansal bir çoğaltma programı sonrasında, S fazında farklı zamanlarda kromozomlar boyunca birçok bölgeden başlatır. Çoğaltma zamanlaması özellikleri epigenetik değişikliklere duyarlı doku-spesifik ve gelişimsel ipuçları tarafından düzenlenen dinamik bir süreç olduğu düşünülmektedir. Ancak, nerede ve DNA replikasyonu kromozomlar boyunca başlattığında düzenleyen mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Homolog kromozomlar genellikle ancak bu kuralın önemli istisnalar vardır, eşzamanlı çoğaltırlar. Örneğin, dişi memeli hücrelerinde iki X kromozomu X inaktivasyonu 1 olarak bilinen bir süreç yoluyla geç kopyalayan olur. 2-3 saat olarak tahmin çoğaltma zamanlaması, bu gecikme ile birlikte, genlerin çoğunluğu transkripsiyonel bir X kromozomu üzerinde susturdu olur. Buna ek olarak, X inaktivasyonu merkezi olarak bilinen bir ayrık cis-hareket eden odağı, th dahil olmak üzere, bu X inaktivasyonu işlem düzenlertüm inaktif X kromozomu üzerinde gecikmiş çoğaltma zamanlaması e indüksiyonu. Buna ek olarak, kanser hücreleri ve hücreler bulunan bazı kromozom tüm kromozom 2,3 etkilemektedir> 3 saat bunun çoğaltma zamanlaması önemli bir gecikme görüntülemek iyonizan radyasyona maruz. Bizim laboratuvar son çalışmaları ayrık olduğunu bozulması cis-oyunculuk tüm kromozom 4 etkileyen bir çok geç kopyalayan fenotipe otozomal lokus sonucu gösterir. Ek 'kromozom mühendislik' çalışmaları tüm memeli kromozomları bireyin kromozom Uygun çoğaltma zamanlaması 5 kontrol ayrık cis-etkili lokus içeren düşündüren, bu anormal çoğaltma zamanlaması fenotipe birçok farklı kromozom sonucu etkileyen bazı kromozom göstermektedir.
Burada, floresan in situ hibridizasyon ile kombine kromozom çoğaltma zamanlaması kantitatif analizi için bir yöntem mevcut. Buyöntem, aynı hücre içinde Homolog kromozomlar arasındaki çoğaltma zamanlaması doğrudan bir karşılaştırma sağlar, ve 6 uyarlanmıştır. Buna ek olarak, bu yöntem tam kromozom replikasyonu zamanlama etkileyen değişiklikler ile ilişkili kromozomal düzenlenmesinde çok kesin tanımlanması için olanak sağlar. Bu yöntem son yıllarda geliştirilen yüksek kapasiteli mikro-dizi üzerinde veya yeniden düzenlenmiş ve kromozomlar un düzenlenmeyecek üzerinde sunmaktan homolog allelleri arasındaki farkı ayırt edemez protokolleri sıralama avantajları vardır. Burada açıklanan yöntem tek hücreler değerlendirir Buna ek olarak, bu bir nüfus içinde hücrelerin sadece küçük bir bölümü içinde mevcut olan kromozom üzerinde çevrilme kromozom replikasyonu zamanlama değişiklikleri tespit eder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kromozom yayılır hazırlanması burada açıklanan başarılı çoğaltma-zamanlama testi için kritik bir adımdır. Hipotonik tedavi öncesinde colcemid ön adım dahil sıklığı ve mitotik hücrelerin yayılmasını yardımcı olabilir. Bu tipik olarak hasat öncesi 1-3 saat için colcemdi hücrelerin ortaya çıkarmak, ve 10 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda colcemid kullanımı. Ancak, ön arıtma adımı colcemid dahil G2 uzunluğu değiştirebilir ve dolayısıyla kromozom 3'ün yoğun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü, CA131967 bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Anti-BrdU-FITC | Roche Millipore | 11202593001 MAB326F | 50 μg/μl |
| Nick Translation Kit | Abbott Molecular (Vysis) | 07J00-0001 | |
| Spectrum Orange dUTP | Abbott Molecular (Vysis) | 02N33-050 | |
| CEP | Abbott Molecular (Vysis) | Varies | |
| LSI/WCP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 06J67-011 | |
| CEP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 07J36-001 | |
| Chromosome paints | MetaSystems Group | D-14NN-050-TR | |
| Olympus BX61 Fluorescent Microscope | Olympus | BX61TRF-1-5 | |
| Microscope imaging software system | Applied Imaging | Cytovision 3.93.1 | |
| Digital Camera | Olympus | UCMAD3 | |
|
IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES 35 ml Formamide* (Sigma) * It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamide (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)] Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots). 0.1 M NaH2P04 , 1 L 13.8 g NaH2P04 (Sigma): 0.1 M NaH2P04 1 L 14.2 g NaH2P04 (Sigma) PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40. PNM 50 ml 1.25 g Non-fat dry milk (Sigma) Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins. |
References
- Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).
- Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation. 암 연구학. 64, 8231-8238 (2004).
- Smith, L., Plug, A., Thayer, M. Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).
- Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression. Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).
- Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing. Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).
- Camargo, M., Cervenka, J. Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model. Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).
- Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts. Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).
- Diaz-Perez, S., et al. The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse. 유전학. 171, 663-672 (2005).
- Diaz-Perez, S. V., et al. A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes. 유전학. 174, 1115-1133 (2006).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
- Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. Allelic inactivation of rDNA loci. Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).
- Branzei, D., Foiani, M. The checkpoint response to replication stress. DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).
