Kromosom Replikerer Timing Kombineret med Fluorescent<em> In situ</em> Hybridisering
Summary
En kvantitativ metode til analyse af kromosomreplikation timing er beskrevet. Fremgangsmåden anvender BrdU-inkorporering i kombination med fluorescerende<em> In situ</em> Hybridisering (FISH) til at vurdere replikation timingen af mammale kromosomer. Denne teknik giver mulighed for direkte sammenligning af omlejrede og un-omlejrede kromosomer i samme celle.
Abstract
Mammalian DNA-replikation initierer flere steder langs kromosomer på forskellige tidspunkter i løbet af S-fasen, efter en tidsmæssig replikation program. Specifikationen af replikation timing menes at være en dynamisk proces, reguleret af vævsspecifikke og udviklingsmæssige signaler, som reagerer på epigenetiske modifikationer. Men de mekanismer, der regulerer, hvor og hvornår DNA-replikation starter langs kromosomerne stadig dårligt forstået. Homologe kromosomer normalt replikere synkront, men der er markante undtagelser fra denne regel. For eksempel en af de to X-kromosomer hos kvindelige pattedyrceller bliver forsinket replikerende gennem en proces, der kaldes X-inaktivering 1. Sammen med denne forsinkelse i replikation timing, skønnes at være 2-3 timer, bliver størstedelen af gener transkriptionelt tavs på én X-kromosom. Desuden regulerer en diskret cis-virkende locus, kendt som X-inaktivering er dette X inaktiveringsproces, herunder the induktion af forsinket replikation timing på hele inaktive X-kromosom. Desuden udsættes visse kromosomomlejringer fundet i cancerceller og i celler for ioniserende stråling vise en væsentlig forsinkelse i replikation timingen af> 3 timer, der påvirker hele kromosom 2,3. Seneste arbejde fra vores laboratorium viser, at afbrydelse af diskrete cis-agerende autosomal loci resulterer i et meget sent replikerende fænotype, der påvirker hele kromosom 4. Yderligere 'kromosom engineering "undersøgelser viser, at visse kromosomomlejringer påvirker mange forskellige kromosomer resultat i denne unormale replikations-timing fænotype, hvilket tyder på, at alle pattedyrs-kromosomer indeholder diskrete cis-virkende loci, der styrer korrekt replikation timingen af individuelle chromosomer 5.
Her præsenteres en metode til kvantitativ analyse af kromosomreplikation timing kombineret med fluorescerende in situ hybridisering. DetteFremgangsmåden muliggør en direkte sammenligning af replikation timing mellem homologe kromosomer i samme celle, og blev tilpasset fra 6. Derudover muliggør denne fremgangsmåde til utvetydig identifikation af kromosomale omlejringer, der korrelerer med ændringer i replikation timing, der påvirker hele kromosomet. Denne metode har fordele i forhold til nyligt udviklede high throughput mikro-array eller sekventering protokoller, der ikke kan skelne mellem homologe alleler stede på omarrangeret og un-omarrangeret kromosomer. Endvidere, fordi den her beskrevne fremgangsmåde evalueres enkelte celler kan detektere ændringer i kromosomreplikation timing for kromosomale omlejringer, der er til stede i kun en fraktion af cellerne i en population.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremstillingen af kromosom spreads er et kritisk skridt for en vellykket replikation-timing assayet beskrevet her. Inddragelsen af et colcemid forbehandling trin forud for hypotonisk behandling kan hjælpe i frekvens og spredning af mitotiske celler. Vi typisk udsætte celler for colcemdi for 1-3 timer før høst, og anvendelse Colcemid i en slutkoncentration på 10 ug / ml. Imidlertid kan medtagelse af et colcemid forbehandlingstrin ændre længden af G2 og derfor kan ændre den åbenbare replikation timing…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Cancer Institute, CA131967.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Anti-BrdU-FITC | Roche Millipore | 11202593001 MAB326F | 50 μg/μl |
| Nick Translation Kit | Abbott Molecular (Vysis) | 07J00-0001 | |
| Spectrum Orange dUTP | Abbott Molecular (Vysis) | 02N33-050 | |
| CEP | Abbott Molecular (Vysis) | Varies | |
| LSI/WCP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 06J67-011 | |
| CEP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 07J36-001 | |
| Chromosome paints | MetaSystems Group | D-14NN-050-TR | |
| Olympus BX61 Fluorescent Microscope | Olympus | BX61TRF-1-5 | |
| Microscope imaging software system | Applied Imaging | Cytovision 3.93.1 | |
| Digital Camera | Olympus | UCMAD3 | |
|
IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES 35 ml Formamide* (Sigma) * It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamide (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)] Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots). 0.1 M NaH2P04 , 1 L 13.8 g NaH2P04 (Sigma): 0.1 M NaH2P04 1 L 14.2 g NaH2P04 (Sigma) PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40. PNM 50 ml 1.25 g Non-fat dry milk (Sigma) Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins. |
References
- Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).
- Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation. 암 연구학. 64, 8231-8238 (2004).
- Smith, L., Plug, A., Thayer, M. Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).
- Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression. Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).
- Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing. Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).
- Camargo, M., Cervenka, J. Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model. Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).
- Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts. Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).
- Diaz-Perez, S., et al. The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse. 유전학. 171, 663-672 (2005).
- Diaz-Perez, S. V., et al. A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes. 유전학. 174, 1115-1133 (2006).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
- Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. Allelic inactivation of rDNA loci. Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).
- Branzei, D., Foiani, M. The checkpoint response to replication stress. DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).
