Summary

형광등과 결합 염색체 복제 타이밍<em> 현장에서</em> 하이브리드

Published: December 10, 2012
doi:

Summary

염색체 복제 타이밍 분석을위한 정량 방법 설명되어 있습니다. 방법은 형광와 함께 BrdU의 설립을 활용<em> 현장에서</em> 포유류의 염색체 복제 타이밍을 평가하는 하이브리드 (물고기). 이 기술은 동일한 세포 내에서 재 배열 및 취소 – 재 배열 염색체의 직접적인 비교를 할 수 있습니다.

Abstract

포유류의 DNA 복제는 일시적 복제 프로그램에 따라, S 단계 동안 다른 시간에 염색체를 따라 여러 사이트에서 시작합니다. 복제 타이밍 사양은 epigenetic 수정에 대한 반응 조직 별 및 발달 신호에 의해 규제 동적 과정이라고 생각합니다. 그러나, 어디에서 DNA 복제가 염색체 함께 시작하면 규제 메커니즘을 제대로 이해 남아 있습니다. 상동 염색체는 보통 그러나이 규칙에 중요한 예외가 있습니다, 동기식 복제합니다. 예를 들어, 여성 포유류의 세포에 두 개의 X 염색체 중 하나는 X의 불 활성화 1로 알려진 과정을 통해 늦은 복제됩니다. 2-3 시간이 될 것으로 추정 복제 타이밍,이 지연과 함께 유전자의 대부분은 transcriptionally 한 X 염색체에 침묵된다. 또한, X의 불 활성화 센터로 알려진 이산 시스 – 연기의 궤적은, 일 포함하여이 X의 불 활성화 과정을 조절전체 비활성 X 염색체에 지연 복제 타이밍의 전자 유도. 또한, 암 세포와 세포에서 발견 특정 염색체 rearrangements는 전체 염색체에게 2,3에 영향을 미치는> 3시간 그 복제 타이밍에 상당한 지연을 표시 이온화 방사선에 노출. 우리 연구실의 최근 작품은 이산의 중단 시스 – 행동의 전체 염색체 (4)에 영향을 미치는 매우 늦은 복제 표현형에 염색체 loci 결과를 나타냅니다. 추가 '염색체 공학'연구는 포유류의 염색체는 각 염색체의 적절한 복제 타이밍 5 제어 이산 시스 – 행동 loci가 포함되어 있다는 제안이 이상 복제 – 타이밍 표현형의 다양한 염색체 결과에 영향을 미치는 특정 염색체 rearrangements를 나타냅니다.

여기, 우리는 현장 하이브리드 화에 형광과 결합 염색체 복제 타이밍의 정량 분석​​하는 방법을 제시한다. 이방법은 동일한 세포 내에서 상동 염색체 간의 복제 타이밍의 직접 비교를 허용, 6에서 적응되었습니다. 또한,이 방법은 전체 염색체에 영향을 복제 타이밍의 변화와 연관 염색체 rearrangements의 모호 식별 할 수 있습니다. 이 방법은 최근에 개발 된 높은 처리량 마이크로 어레이 이상 또는 재 배열 및 염색체를 취소 뜯어을 제시 상동 대립 유전자를 구별 할 수 없습니다 프로토콜을 시퀀싱 장점이 있습니다. 여기에 설명 된 방법은 하나의 셀을 평가하기 때문에 또한, 그것은 인구의 셀의 일부만에 존재하는 염색체 rearrangements의 염색체 복제 타이밍의 변화를 감지 할 수 있습니다.

Protocol

1. BrdU의 설립 (터미널 라벨링) 이전 BrdU의 추가로 150mm 조직 문화 요리 24 시간에 약 70 %의 합류로 플레이트 세포. 전에 수확에 적합한 시간 지점에서 20 μg / ML BrdU (시그마)를 포함하는 신선한 완벽한 미디어와 미디어를 대체합니다. 시간이 세포의 길이는 BrdU는 일반적으로 G2 단계는 시간 (그림 1) 2 사이 5 정도, 세포 유형 및 종과 다를 수있는 미디어에 배양되어 있습니다…

Representative Results

인간의 염색체 6의 복제 타이밍 분석의 예는 그림 2에 표시됩니다. 6q16.1에있는 ASAR6 유전자 4의 삭제를 포함하는 셀은 5 시간에 BrdU에 노출 mitotic 세포에 대한 수확 및 염색체 6 페인트 프로브 (Vysis)와 물고기와 BrdU의 설립에 대한 처리되었습니다. 두 6의 사이 BrdU 구간 패턴에 상당한 차이가 있습니다, 이는 이전에 염색체 6의 [표시 4 염색체 6 패턴을 구간 복제 타이밍에 ?…

Discussion

염색체 확산의 준비는 여기에 설명 된 성공적인 복제 – 타이밍 분석을위한 중요한 단계입니다. hypotonic 치료 전에 colcemid 전처리 단계의 포함은 주파수와 mitotic 세포의 확산에 도움 될 수 있습니다. 우리는 일반적으로 수확하기 전에 1-3 시간에 colcemdi에 세포를 노출, 10 UG / ML의 최종 농도에 colcemid 사용합니다. 그러나, colcemid 전처리 단계의 포함은 G2의 길이를 변경할 수 있으며, 그 결과 염색체 3<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 국립 암 연구소, CA131967의 교부금에 의해 지원되었다.

Materials

Name of Reagent Company Catalogue Number Comments (optional)
Anti-BrdU-FITC Roche Millipore 11202593001 MAB326F 50 μg/μl
Nick Translation Kit Abbott Molecular (Vysis) 07J00-0001  
Spectrum Orange dUTP Abbott Molecular (Vysis) 02N33-050  
CEP Abbott Molecular (Vysis) Varies  
LSI/WCP hybridization buffer Abbott Molecular (Vysis) 06J67-011  
CEP hybridization buffer Abbott Molecular (Vysis) 07J36-001  
Chromosome paints MetaSystems Group D-14NN-050-TR  
Olympus BX61 Fluorescent Microscope Olympus BX61TRF-1-5  
Microscope imaging software system Applied Imaging Cytovision 3.93.1  
Digital Camera Olympus UCMAD3  
     

IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES
Formamide Solutions
70% Formamide/2x SSC

35 ml Formamide* (Sigma)
10 ml 10x SSC
5 ml d2H20
pH to 7.0 with HCl (Sigma)

* It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low.

50% Formamide/2x SSC

25 ml formamide (Sigma)
10 ml 10x SSC
15 ml dH2O
pH to 7.0 with HCl (Sigma)

20x SSC, 4 L

702 g NaCl (Sigma)
358 g Na Citrate (Sigma)
dH2O to volume

PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)]

Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots).

0.1 M NaH2P04 , 1 L

13.8 g NaH2P04 (Sigma):
dH2O to volume

0.1 M NaH2P04 1 L

14.2 g NaH2P04 (Sigma)
dH2O to volume.

PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40.

PNM 50 ml

1.25 g Non-fat dry milk (Sigma)
25 ml PN buffer (Recipe above)

Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins.

References

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Cite This Article
Smith, L., Thayer, M. Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization. J. Vis. Exp. (70), e4400, doi:10.3791/4400 (2012).

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