Voorbereiding van Cell-lijnen voor Conditional Knockdown van genexpressie en meting van de Knockdown Effecten op E4orf4-geïnduceerde celdood
Summary
Bijdrage van de ACF chromatine remodeling factor E4orf4-geïnduceerde celdood werd gemeten. Het protocol omvat selectie celklonen waarin doxycycline induceert voorwaardelijke knockdown van de ACF subeenheden Acf1 en SNF2h en het gebruik van de DAPI assay E4orf4 geïnduceerde celdood meten in de induceerbare cellijnen.
Abstract
Functionele inactivatie van genexpressie in zoogdiercellen is cruciaal voor de studie van de bijdrage van een eiwit van belang verschillende trajecten 1,2. Echter afhankelijk knockdown van genexpressie nodig in gevallen waarin constitutieve knockdown wordt niet getolereerd door de cellen gedurende lange tijd 3-5. Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van cellijnen mogelijk afhankelijk knockdown van subeenheden van de ACF chromatine remodeling factor. Deze cellijnen vergemakkelijken het bepalen van de bijdrage van ACF inductie van celdood door het adenovirus E4orf4 eiwit 6. Sequenties die coderen short hairpin RNAs voor de Acf1 en SNF2h subeenheden van het ACF chromatine hermodellering factor werden naast een doxycycline-induceerbare promoter in een plasmide dat ook een gen voor neomycine resistentie gen gekloneerd. Neomycine-resistente cel klonen werden geselecteerd in de aanwezigheid van G418 en geïsoleerd. De resulterende cellijnen werden geïnduceerd doordoxycycline behandeling en na Acf1 of SNF2h expressie werden verlaagd, werden de cellen getransfecteerd met een plasmide coderend E4orf4 of een lege vector. Het specifieke effect van de shRNA constructen bevestigen werden Acf1 of SNF2h eiwitniveaus hersteld WT niveaus door cotransfectie met een plasmide dat Acf1 of SNF2h die tegen de shRNA die door invoering van stille mutaties. Het vermogen van E4orf4 om celdood te induceren in de verschillende monsters werd bepaald door een assay DAPI, waarbij de frequentie van verschijnen van kernen met apoptotische morfologie in de getransfecteerde celpopulatie werd gemeten 7-9.
De hier beschreven protocol kan worden gebruikt voor het bepalen van de functionele bijdrage van diverse eiwitten inductie van celdood door hun eiwit partners in gevallen waarin constitutieve knockdown cel kan dodelijk zijn.
Protocol
Discussion
Knockdown van genexpressie is een belangrijke benadering voor het onderzoek naar de bijdrage van een eiwit regulerende pathways. Sinds constitutieve knock-down van de expressie van essentiële genen een negatieve invloed op de celproliferatie, kunnen hun studie nodig hebben, hetzij van voorbijgaande aard introductie van siRNA's of de toepassing van een stabiele voorwaardelijke knockdown systemen. Genereren van stabiele cellijnen met het vermogen tot drug-geïnduceerde expressie van shRNAs hier beschreven, een voorde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund (gedeeltelijk) door de Israel Science Foundation (Grant 399/11), door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) in het kader van de Duits-Israëlische Project Samenwerking (DIP), en door de Rappaport familie Instituut voor Onderzoek in de Medische Wetenschappen.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer. 2, 243-247 (2002).
- Czauderna, F. Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model. Nucleic acids research. 31, e127 (2003).
- Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns. Nucleic acids research. 31, e77 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. Journal of. 77, 8957-8961 (2003).
- Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes. Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).
- Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway. J. Virol. 75, 789-798 (2001).
- Shtrichman, R., Kleinberger, T. Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells. J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).
- Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B’ subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba. Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).
- Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).
- Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk. J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).
- Li, S. The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells. Oncogene. 28, 390-400 (2009).
- Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -. C., Robert, A. Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases. J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).
