Preparazione di linee cellulari per Knockdown condizionale dell'espressione genica e valutazione degli effetti sulla Knockdown E4orf4 morte cellulare indotta
Summary
Contributo del fattore ACF rimodellamento della cromatina per E4orf4 morte cellulare indotta è stata misurata. Il protocollo include la selezione di cloni di cellule in cui il trattamento doxiciclina induce knockdown condizionale della subunità ACF ACF1 e SNF2h, e l'uso del test per misurare DAPI E4orf4 morte cellulare indotta in linee cellulari inducibili.
Abstract
Inattivazione funzionale di espressione genica in cellule di mammiferi è fondamentale per lo studio del contributo di una proteina di interesse per varie vie 1,2. Tuttavia, knockdown condizionale dell'espressione genica è necessaria nei casi in cui knockdown costitutiva non è tollerata dalle cellule per un lungo periodo di tempo 3-5. Qui si descrive un protocollo per la preparazione di linee cellulari che permettono knockdown condizionale della subunità del fattore ACF rimodellamento della cromatina. Queste linee cellulari facilitare la determinazione del contributo di ACF ad induzione di morte cellulare per la proteina adenovirus E4orf4 6. Sequenze codificanti short hairpin RNA per le subunità ACF1 SNF2h e del fattore di ACF rimodellamento della cromatina sono stati clonati accanto a un doxiciclina promotore inducibile in un plasmide contenente un gene anche per il gene di resistenza alla neomicina. Neomicina resistenti cloni sono stati selezionati in presenza di G418 e isolata. Le linee cellulari risultanti sono state indottetrattamento doxiciclina, e una volta ACF1 o livelli di espressione SNF2h stati ridotti, le cellule sono state transfettate con un plasmide codificante E4orf4 o un vettore vuoto. Per confermare l'effetto specifico dei costrutti shRNA, i livelli di proteina ACF1 o SNF2h sono stati ripristinati ai livelli WT da coinfezione con un plasmide che esprime ACF1 o SNF2h cui erano stati resi resistenti al shRNA con l'introduzione di mutazioni silenti. La capacità di E4orf4 di indurre la morte cellulare nei vari campioni è stata determinata mediante un saggio DAPI, in cui è stata misurata la frequenza della comparsa di nuclei con morfologie apoptotici nella popolazione di cellule transfettate 7-9.
Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per la determinazione del contributo funzionale di varie proteine di induzione della morte cellulare dai loro partner proteici nei casi in cui knockdown costitutiva può essere letale cellula.
Protocol
Discussion
Knockdown di espressione del gene specifico è un approccio importante per l'indagine del contributo di una proteina a percorsi normativi. Dal momento che knockdown costitutiva di espressione dei geni essenziali influisce negativamente la proliferazione delle cellule, il loro studio hanno bisogno di un introduzione transitoria di siRNA o applicazione di stabili sistemi smontabili condizionali. Generazione di linee cellulari stabili con la capacità di farmaco-indotta espressione di shRNAs qui descritte, fornisce un …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato (in parte) con la Israel Science Foundation (Grant 399/11), dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), nel quadro della convenzione tedesco-israeliano di cooperazione Progetto (DIP), e dall'Istituto famiglia Rappaport per la Ricerca in le scienze mediche.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
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