הכנה של קווים סלולריים למציאה מותנית של ביטוי גנים ומדידה של השפעות על מציאת מות תאי E4orf4-induced
Summary
תרומתו של גורם שיפוץ הכרומטין ACF למוות של תאי E4orf4 מושרה נמדדה. הפרוטוקול כולל מבחר של שיבוטים של תאים שבם טיפול דוקסיציקלין גורם מציאה מותנית של ACF יחידות המשנה Acf1 וSNF2h, ולהשתמש של assay DAPI למדוד מות תאים E4orf4 מושרה בשורות התאים מושרות.
Abstract
אינאקטיבציה פונקציונלית של ביטוי גנים בתאי יונקים היא חיונית ללימוד התרומה של חלבון של עניין ל1,2 מסלולים השונים. עם זאת, מציאה מותנית של ביטוי גנים נדרשה במקרים שבי מציאה מכוננת אינה נסבלת על ידי תאים לתקופה ארוכה של זמן 3-5. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנה של שורות תאים המאפשרות מציאה מותנית של יחידות משנה של גורם שיפוץ הכרומטין ACF. שורות תאים אלו יקלו לקבוע את תרומתו של ACF לאינדוקציה של מוות של תאים על ידי E4orf4 חלבון אדנווירוס 6. רצפי קידוד RNAs מכבנה הקצרה ליחידות משנת Acf1 וSNF2h של גורם שיפוץ הכרומטין ACF היו משובטים ליד אמרגן דוקסיציקלין-מושרה בפלסמיד המכיל גם גן לגן התנגדות נאומיצין. שיבוטים סלולריים neomycin עמידים נבחרו בנוכחות G418 ומבודד. שורות התאים וכתוצאה מכך נגרמות על ידיטיפול דוקסיציקלין, ופעם Acf1 או רמות הביטוי SNF2h הופחתו, התאים היו transfected עם קידוד פלסמיד E4orf4 או וקטור ריק. כדי לאשר את ההשפעה הספציפית של מבני shRNA, רמות חלבון Acf1 או SNF2h שוקמו לרמות WT ידי cotransfection עם פלסמיד Acf1 להביע או SNF2h שניתן היו עמיד לshRNA ידי הקדמה של מוטציות שקטות. היכולת של E4orf4 לגרום למוות של תאים בדגימות השונות נקבעה על ידי assay DAPI, שבתדירות ההופעה של גרעינים עם מורפולוגיות אפופטוטיים באוכלוסיית תאי transfected נמדדה 7-9.
הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מנוצל עבור לקבוע את תרומתו הפונקציונלית של חלבונים שונים לאינדוקציה של מוות של תאים על ידי שותפי החלבון שלהם במקרים שבי מציאה מכוננת עשויה להיות תא קטלני.
Protocol
Discussion
מציאה של ביטוי גנים ספציפיים היא גישה חשובה לחקירה של התרומה של חלבון למסלולים רגולטוריים. מאז מציאה מכוננת של ביטוי של גנים חיוניים משפיעה לרעה על שגשוג תאים, מחקרם עשוי לדרוש גם הקדמה חולפת של siRNAs או יישום של מערכות מציאה מותנות יציבות. הדור של שורות תאי יציבות עם ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה (בחלקו) על ידי קרן הלאומי למדע (גרנט 399/11), על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG) במסגרת שיתוף הפעולה בין גרמניה לישראל פרויקט (מח"ש), ועל ידי מכון רפפורט לחקר המשפחה ב מדעי הרפואה.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer. 2, 243-247 (2002).
- Czauderna, F. Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model. Nucleic acids research. 31, e127 (2003).
- Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns. Nucleic acids research. 31, e77 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. Journal of. 77, 8957-8961 (2003).
- Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes. Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).
- Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway. J. Virol. 75, 789-798 (2001).
- Shtrichman, R., Kleinberger, T. Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells. J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).
- Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B’ subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba. Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).
- Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).
- Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk. J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).
- Li, S. The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells. Oncogene. 28, 390-400 (2009).
- Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -. C., Robert, A. Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases. J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).
