Summary

जीन और पछाड़ना E4orf4 प्रेरित कोशिका मृत्यु पर प्रभाव की अभिव्यक्ति मापन के सशर्त पछाड़ना के लिए सेल लाइनों की तैयारी

Published: October 21, 2012
doi:

Summary

ACF chromatin remodeling E4orf4 प्रेरित कोशिका मृत्यु के कारक का योगदान मापा गया था. प्रोटोकॉल सेल क्लोनों में डॉक्सीसाइक्लिन उपचार ACF सब यूनिटों Acf1 और SNF2h सशर्त पछाड़ना लाती का चयन भी शामिल है, और DAPI परख का उपयोग inducible सेल लाइनों में E4orf4 प्रेरित कोशिका मृत्यु को मापने.

Abstract

स्तनधारी कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति के कार्यात्मक निष्क्रियता विभिन्न रास्ते 1,2 के लिए ब्याज की एक प्रोटीन के योगदान के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, जीन अभिव्यक्ति की सशर्त पछाड़ना मामलों में आवश्यक है जब विधान पछाड़ना कोशिकाओं द्वारा 3-5 समय की एक लंबी अवधि के लिए बर्दाश्त नहीं किया है. यहाँ हम सेल लाइनों ACF chromatin remodeling कारक के सब यूनिटों की सशर्त पछाड़ना की अनुमति की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. ये सेल लाइनों adenovirus E4orf4 6 प्रोटीन कोशिका मृत्यु का प्रेरण ACF के योगदान के निर्धारण की सुविधा. ACF chromatin remodeling कारक के Acf1 और SNF2h सब यूनिटों के लिए छोटे बाल के लिये कांटा RNAs एन्कोडिंग दृश्यों प्लाज्मिड भी Neomycin प्रतिरोध जीन के लिए एक जीन युक्त में एक प्रमोटर डॉक्सीसाइक्लिन-inducible अगले क्लोन किया गया. Neomycin प्रतिरोधी सेल क्लोनों G418 और पृथक की उपस्थिति में चयन किया गया था. परिणामस्वरूप सेल लाइनों से प्रेरित थेडॉक्सीसाइक्लिन उपचार Acf1 एक बार या SNF2h अभिव्यक्ति का स्तर कम हो गई थी, कोशिकाओं एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग E4orf4 या एक खाली वेक्टर साथ ट्रांसफ़ेक्ट रहे थे. ShRNA constructs का विशेष प्रभाव की पुष्टि है, Acf1 या SNF2h प्रोटीन का स्तर cotransfection द्वारा एक प्लाज्मिड व्यक्त Acf1 या SNF2h जो shRNA मूक म्यूटेशनों की शुरूआत करने के लिए प्रतिरोधी द्वारा गाया गया था के साथ WT स्तर के लिए बहाल कर दिया गया. E4orf4 की क्षमता विभिन्न नमूनों में कोशिका मृत्यु को उत्पन्न एक DAPI परख, जिसमें ट्रांसफ़ेक्ट सेल आबादी में apoptotic morphologies के साथ नाभिक की उपस्थिति की आवृत्ति 7-9 मापा गया था द्वारा निर्धारित किया गया था.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल विभिन्न प्रोटीन के कार्यात्मक योगदान के मामलों में अपने भागीदारों द्वारा प्रोटीन कोशिका मृत्यु के शामिल होने के लिए दृढ़ संकल्प के लिए उपयोग किया जा सकता है जब विधान पछाड़ना सेल घातक हो सकता है.

Protocol

1. Inducible सेल लाइन्स की पीढ़ी पहले प्रयोग एक दवा G418 के न्यूनतम एकाग्रता जो सभी वांछित सेल लाइनों की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं को मारता है खोजने की जरूरत है. इस प्रयोजन के लिए, 70% मध्यम है कि प्रय…

Discussion

विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति की पछाड़ना विनियामक रास्ते के लिए एक प्रोटीन के योगदान की जांच करने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है. आवश्यक जीन की अभिव्यक्ति के विधान पछाड़ना नकारात्मक सेल प्रसार को प्रभावि?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम (भाग में) इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान 11/399), ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) परियोजना जर्मन – इजरायल सहयोग (डुबकी) के ढांचे के भीतर, और Rappaport परिवार में अनुसंधान के लिए संस्थान द्वारा समर्थित किया गया मेडिकल साइंसेज.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
High glucose DMEM Gibco 41965
Tet system approved FBS Clontech 631106
L-glutamine Gibco 25030
Pen Strep Gibco 15140
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200
T-REx-293 cells Invitrogen R710-07
G418 Sigma A1720
blasticidin Invitrogen R210-01
pSuperior.neo+GFP plasmid OligoEngine VEC-PBS-0007/0008
jetPIE Polyplus transfection 101-40
doxycycline Sigma D9891
paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma D9542
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01

References

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Cite This Article
Brestovitsky, A., Sharf, R., Kleinberger, T. Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death. J. Vis. Exp. (68), e4442, doi:10.3791/4442 (2012).

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