遺伝子発現とE4orf4誘発細胞死にノックダウン効果の測定のための条件付きノックダウン細胞株の作製
Summary
E4orf4誘導細胞死へのACFのクロマチンリモデリング因子の寄与を測定した。プロトコルはドキシサイクリン治療がACFユニットAcf1とSNF2hの条件付きノックダウンを誘導し、誘導細胞株でE4orf4誘導される細胞死を測定するためのDAPIアッセイを使用した細胞クローンの選択が含まれています。
Abstract
哺乳動物細胞における遺伝子発現の機能的不活性化は、様々な経路1,2に、目的のタンパク質の寄与の研究にとって極めて重要である。構成的なノックダウンが時間3月5日の長い期間のための細胞によって許容されていない場合しかし、遺伝子発現のノックダウン条件は場合に必要です。ここでは、ACFのクロマチンリモデリング因子のサブユニットの条件付きノックダウンを可能にする細胞株を調製するためのプロトコルを記述します。これらの細胞株は、アデノウイルスE4orf4タンパク質6による細胞死の誘導へのACFの寄与の決定を容易にする。 ACFのクロマチンリモデリング因子のAcf1とSNF2hサブユニットに対する短いヘアピンRNAをコードする配列はまた、ネオマイシン耐性遺伝子の遺伝子を含むプラスミドでドキシサイクリン誘導性プロモーターの隣にクローン化した。ネオマイシン耐性細胞クローンは、G418と孤立の存在下で選択した。得られた細胞ラインはによって誘発されたドキシサイクリン治療は、一度Acf1またはSNF2h発現レベルが低下した、細胞をコードするプラスミドE4orf4または空ベクターでトランスフェクトした。 shRNAコンストラクトの具体的な効果を確認するために、Acf1またはSNF2hタンパク質レベルはサイレント変異を導入することにより、shRNAのに耐性がレンダリングされた発現プラスミドAcf1またはSNF2hと共トランスフェクションすることにより、WTのレベルに復元されました。様々な試料に細胞死を誘導するE4orf4の能力は、トランスフェクトされた細胞集団におけるアポトーシスの形態を有する核の出現頻度が7-9を測定されたDAPIのアッセイによって決定した。
構成的なノックダウン細胞が致死であるかもしれない場合、ここで説明プロトコルは場合に限り、そのタンパク質パートナーによる細胞死の誘導に種々のタンパク質の機能的貢献の決定に利用することができる。
Protocol
Discussion
特定の遺伝子発現のノックダウンは調節経路へのタンパク質の寄与の捜査に重要なアプローチである。必須遺伝子の発現の構成的なノックダウンが否定的に細胞増殖に影響を与えるので、それらの研究では、一時的なsiRNAの導入や安定した条件付きノックダウンシステムのアプリケーションのいずれかを必要とするかもしれません。ここで説明するshRNAの薬物誘発性の発現のための容量を持つ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ドイツとイスラエルのプロジェクト協力（DIP）の枠組みの中で、ドイツ学術振興協会（DFG）によるイスラエル科学財団（グラント11分の399）によって、との研究のためのラパポートファミリー研究所（部分的に）サポートされていました医科学。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer. 2, 243-247 (2002).
- Czauderna, F. Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model. Nucleic acids research. 31, e127 (2003).
- Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns. Nucleic acids research. 31, e77 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. Journal of. 77, 8957-8961 (2003).
- Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes. Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).
- Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway. J. Virol. 75, 789-798 (2001).
- Shtrichman, R., Kleinberger, T. Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells. J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).
- Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B’ subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba. Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).
- Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).
- Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk. J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).
- Li, S. The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells. Oncogene. 28, 390-400 (2009).
- Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -. C., Robert, A. Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases. J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).
