Molecular Imaging Transplantierte Muscle Progenitor Zielzellen
Summary
Ein nicht-invasiver Mittel, um den Erfolg der Transplantation Myoblasten auszuwerten beschrieben. Das Verfahren nutzt ein einheitliches Fusionsprotein Reportergen, dessen Expression von Genen kann mit unterschiedlichen Bildgebungsverfahren abgebildet werden zusammengesetzt. Hier nutzen wir ein<em> Fluc</em> Reporter Gensequenz Zellen über Biolumineszenz-Bildgebung zielen.
Abstract
Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine schwere, genetisch bedingte neuromuskuläre Erkrankung, die 1 wirkt in 3.500 Jungen und zeichnet sich durch progressiven Muskelschwund 1, 2 gekennzeichnet. Bei Patienten, wird die Fähigkeit der Bewohner Muskel-Satelliten-Zellen (SCs), um beschädigte Muskelfasern regenerieren zunehmend ineffizient 4. Daher ist die Transplantation von Muskel-Vorläuferzellen (MPL) / Myoblasten von gesunden Probanden ein vielversprechender therapeutischer Ansatz zur DMD. Eine wesentliche Einschränkung auf die Verwendung von Stammzelltherapie ist jedoch ein Mangel an zuverlässigen bildgebenden Technologien zur Langzeitüberwachung von implantierten Zellen und zum Auswerten ihrer Wirksamkeit. Hier beschreiben wir eine nicht-invasive Echtzeit-Ansatz, um den Erfolg der Myoblasten Transplantation zu bewerten. Dieses Verfahren nutzt die Vorteile eines einheitlichen Reportergen-Fusion der Gene aus (Firefly Luziferase [fluc], monomere rot fluoreszierendes Protein [mRFP] und sr39 Thymidinkinase [sr39tk]), dessen Expression können mit unterschiedlichen Abbildungsmodalitäten 9, 10 abgebildet werden. Eine Vielzahl von bildgebenden Verfahren, einschließlich Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Single-Photon-Emissions-Computertomographie (SPECT), Kernspintomographie (MRI), optische Bildgebung, und Hochfrequenz 3D-Ultraschall sind nun mit jeweils eindeutigen Vorteile und Einschränkungen 11. Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) Studien, zum Beispiel, haben den Vorteil, dass relativ geringen Kosten und hohem Durchsatz. Es ist aus diesem Grund, der in dieser Studie, nutzen wir der Firefly Luziferase (fluc) Reportergen Sequenz innerhalb des Fusionsgens und Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) für die kurzfristige Lokalisierung von lebensfähigen C2C12 Myoblasten enthalten nach der Implantation in eine Maus Modell DMD (Muskeldystrophie auf dem X-Chromosom [mdx] mouse) 12-14. Wichtig ist, bietet BLI uns ein Mittel, um die Kinetik der markierten MPCs nach der Implantation zu prüfen, und wird nützlich sein, um Zellen zu verfolgen wiederholt über time und nach der Migration. Unser Reporter-Gen Ansatz weiter ermöglicht uns, mehrere bildgebende Verfahren in einem einzigen lebenden Subjekt verschmelzen; angesichts der tomographischen Natur, feine räumliche Auflösung und die Fähigkeit zur Skalierung auf bis zu größeren Tieren und Menschen 10,11, wird PET bilden die Grundlage für die künftige Arbeit, dass wir schlagen kann ermöglichen eine schnelle Übersetzung von Methoden in Zellen präklinischen Modellen und klinische Anwendungen entwickelt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie haben wir eine schnelle und zuverlässige molekulare Bildgebung, Reportergen Ansatz zur nicht-invasiven Ziel Myoblasten / MPCs beschrieben nach der Transplantation. Während diese Studie demonstriert die kurzfristige Lokalisierung von transplantierten MPCs über bioluminescense Bildgebung (BLI), der Art, in der Zellen ausgerichtet sind können in der Tat leicht zu einer longitudinalen Beurteilung Engraftment aufgebracht werden, durch die Implantation von Zellen, die stabil exprimieren …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Sanjiv Gambhir für das Geschenk des fluc/mrfp/sr39tk Reportergen danken. Diese Arbeit wurde von The Stem Cell Network (SCN) von Kanada und des Jesse Journey Foundation finanziert.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
- Emery, A. E. The muscular dystrophies. Lancet. 359, 687-695 (2002).
- Blake, D. J., et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Goldring, K., Partridge, T., Watt, D. Muscle stem cells. J. Pathol. 197, 457-467 (2002).
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Moss, F. P., Leblond, C. P. Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats. Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).
- Snow, M. H. An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats. Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol. Med. 14 (2), 82 (2008).
- Hoffman, E. P., et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne’s or Becker’s muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67 (7), 3085 (2007).
- Ray, P., et al. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Mattson, M. P. . Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience. X, 294 (2001).
- Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse. J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).
