Den MultiBac Protein Complex produksjonsplattform på EMBL
Summary
Protein komplekser katalysere viktige cellulære funksjoner. Detaljert funksjonell og strukturell karakterisering av mange essensielle komplekser krever rekombinant produksjon. MultiBac er en Baculovirus / insekt celle system spesielt skreddersydd for å uttrykke eukaryote proteiner og deres komplekser. MultiBac ble gjennomført som en åpen tilgang plattform, og standard operasjonsprosedyrer utviklet for å maksimere sin nytte.
Abstract
Proteomikk forskning avdekket den imponerende kompleksitet av eukaryote proteom i enestående detalj. Det er nå en vanlig akseptert oppfatning at proteiner i cellene for det meste ikke eksistere som isolerte enheter, men utøver sin biologiske aktivitet i forbindelse med mange andre proteiner, i mennesker ti eller mer, danner samlebånd i cellen for de fleste om ikke alle vitale funksjoner. Ett , 2 Kjennskap til funksjon og arkitektur av disse multiprotein forsamlinger krever sin bestemmelse i overlegen kvalitet og tilstrekkelig mengde for detaljert analyse. Den sparsommelige mange protein komplekser i cellene, spesielt i eukaryoter, forbyr deres utvinning fra innfødte kilder, og nødvendiggjør rekombinant produksjon. Baculovirus-ekspresjonsvektor-system (bevs) har vist seg å være spesielt nyttig for å produsere eukaryote proteiner, er avhengig av aktiviteten av dem ofte på post-translasjonell prosessering som andre vanlig brukte ekspresjonssystemer kan derimot ofteikke støtte. tre bevs bruke en rekombinant baculovirus i hvilke genet av interesse ble innsatt for å infisere insekt cellekulturer som i sin tur produserer proteinet av valget. MultiBac er en bevs som har blitt spesielt tilpasset for fremstilling av eukaryote protein komplekser som inneholder mange subenheter. 4. En viktig forutsetning for effektiv produksjon av proteiner og deres komplekser er robuste protokoller for alle trinn involvert i et uttrykk eksperiment som ideelt kan implementeres som standard operasjonsprosedyrer (SOP) og fulgt også av ikke-spesialiserte brukere med komparative letthet. Den MultiBac plattformen ved European Molecular Biology Laboratory (EMBL) bruker SOP for alle trinnene involvert i en multiprotein komplekst uttrykk eksperiment, fra innsetting av genene til en konstruert baculoviral genom optimalisert for heterologe protein produksjonsegenskaper til små-skala analyse av protein eksemplarer produsert. 5-8 The plattformer installert i et open-access-modus ved EMBL Grenoble og har støttet mange forskere fra akademia og industrien til å akselerere protein komplekse forskningsprosjekter.
Introduction
Biologisk aktivitet kontrolleres av sammenstillinger av proteiner og andre biomolekyler som virker sammen for å katalysere cellulære funksjoner. Kjente eksempler er maskiner som transcribes den arvelige informasjonen i DNA til messenger RNA. Hos mennesker, mer enn 100 proteinene kommer sammen i et definert og regulert prosess for å transkribere gener, utvikler store multiprotein komplekser med 10 og flere subenheter inkludert RNA-polymerase II og de generelle transkripsjonsfaktorer slik som TFIID, TFIIH og andre. 9. Andre eksempler er ribosomet, som består av mange proteiner og RNA-molekyler, som katalyserer proteinsyntese, eller det nukleære pore komplekset som er ansvarlig for skytteltrafikk biomolekyler gjennom den kjernefysiske konvolutt i eukaryoter. En detaljert arkitektonisk og biokjemiske disseksjon hos omtrent alle multikomponente maskiner i cellen er viktig å forstå deres funksjon. Strukturen klarlegging av prokaryote og eukaryotic ribosomer, for eksempel, utgjorde kjennetegn hendelser ettergivende enestående innblikk i hvordan disse makromolekylære maskiner utføre sine utpekte funksjoner i cellen. 10,11
Ribosomer kan oppnås i tilstrekkelig kvalitet og kvantitet for detaljert studium ved rensing av det endogene materiale fra dyrkede celler, på grunn av det faktum at opptil 30% av den cellulære masse består av ribosomene. RNA polymerase II er allerede mindre rikelig ved størrelsesordener, og mange tusen liter av gjærkultur måtte bli behandlet for å oppnå et detaljert atom lys av dette vesentlig komplekset sentralt for transkripsjon. 12. Det overveldende flertall av de andre essensielle komplekser er imidlertid til stede i mye lavere beløp i innfødte celler, og dermed kan ikke bli renset tilstrekkelig fra innfødte kildematerialet. Å gjengi slike komplekser tilgjengelig for detaljert strukturell og funksjonell analyse krever heterologe produksjon ved hjelp av rekombinant techniques.
Rekombinant protein produksjonen hadde en stor innvirkning på livet forskning. Mange proteiner ble produsert rekombinant, og deres struktur og funksjon dissekert ved høy oppløsning. Strukturelle genomikk programmene har tatt nytte av klarlegging av genomet hos mange organismer for å løse genproduktet repertoar av hele organismer i high-throughput (HT)-modus. Tusenvis av protein strukturer har dermed fastslått. Til dags dato har det mest frodig brukte system for rekombinant protein produksjonen vært E. coli, og mange uttrykk systemer har blitt utviklet og forfinet gjennom årene for heterolog produksjon i denne verten. De plasmider skjuler en mengde funksjoner for å muliggjøre protein produksjon i E. coli fylle hele kataloger av kommersielle leverandører.
Men E. coli har visse begrensninger som gjør den uegnet til å produsere mange eukaryotiske proteiner og i partikulære protein komplekser med mange subenheter. Derfor har protein produksjon i eukaryote verter blitt stadig metoden for valg de siste årene. En spesielt godt egnet system for å produsere eukaryote proteiner er baculovirus-ekspresjonsvektor-system (bevs) som er avhengig av et rekombinant baculovirus som bærer heterologe gener for å infisere insekt cellekulturer dyrket i laboratoriet. Den MultiBac systemet er en mer nylig utviklede bevs som er spesielt tilpasset for fremstilling av eukaryote protein-komplekser med mange subenheter (fig. 1). MultiBac ble først innført i 2004. 13. Siden lanseringen har MultiBac er stadig blitt videreutviklet og stream-lined å forenkle håndteringen, forbedre målprotein kvalitet og generelt gjøre systemet tilgjengelig for ikke-spesialiserte brukere ved å utforme effektive standard operasjonsprosedyrer (SOP). 4 MultiBac har vært gjennomført i mange laboratorier over hele verden, i academia og industri. På EMBL i Grenoble, ble transnasjonale tilgang til programmer satt på plass av EU-kommisjonen for å gi ekspert opplæring på MultiBac plattform for forskere som ønsket å bruke denne produksjonen system for å fremme sin forskning. Struktur og funksjon av mange protein komplekser som hittil har vært ikke tilgjengelig ble belyst ved hjelp av prøver produsert med MultiBac. 4. I det følgende omtales de viktigste trinnene i MultiBac produksjon oppsummert i protokoller som de er i drift på MultiBac anlegget på EMBL Grenoble.
Protocol
Representative Results
Discussion
Video-snap-skudd i Figurene 2 og 3 illustrerer hele prosessen fra robot-assistert generasjon fra cDNA av multigene ekspresjonskonstruksjoner hele veien til infeksjon av insekt-cellekulturer for protein produksjon. Nye reagenser (plasmider og virus) og robuste protokoller er utviklet for å muliggjøre en rørledning avhengig av SOP. Hele rørledningen har blitt implementert som en plattform teknologi ved EMBL i Grenoble. Den MultiBac plattformen er vist av mange forskere fra akademia og…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond og alle tidligere og nåværende medlemmer av Berger laboratorium for hjelp og råd. Den MultiBac plattformen og dens utvikling har vært og er sjenerøst støttet av virkemiddelapparatet inkludert den sveitsiske National Science Foundation (SNSF), den Agence National de Recherche (ANR) og Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) og EU-kommisjonen (EC) i rammeprogrammene (FP) 6 og 7. Støtte for transnasjonal tilgang er gitt av EF FP7 prosjekter P-Cube ( www.p-cube.eu ) og BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). Den franske departementet for vitenskap er spesielt anerkjent for å støtte MultiBac plattformen ved EMBL gjennom Investissement d'Avenir prosjektet FRISBI.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. The molecular sociology of the cell. Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).
- Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
- Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).
- Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).
- Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells. J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).
- Thomas, M. C., Chiang, C. M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).
- Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. Atomic structures of the eukaryotic ribosome. Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).
- Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. 288 (5466), 640-649 (2000).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).
- Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering. Nat. Protocols. , (2009).
- Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).
- Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, Structure of the mitotic checkpoint complex. Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).
- Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a. Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).
