De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL
Summary
Eiwitcomplexen katalyseren belangrijke cellulaire functies. Gedetailleerde functionele en structurele karakterisering van vele essentiële complexen vereist recombinante productie. MultiBac is een baculovirus / insectencelsysteem vooral afgestemd voor het uitdrukken van eukaryote eiwitten en hun complexen. MultiBac werd geïmplementeerd als een open-access platform en standaard operationele procedures ontwikkeld om het nut te maximaliseren.
Abstract
Proteomics onderzoek bleek de indrukwekkende complexiteit van eukaryote proteomen in ongekend detail. Het is nu een algemeen bekend begrip dat eiwitten in cellen bestaan meestal niet als geïsoleerde gegeven maar oefenen hun biologische activiteit in combinatie met vele andere eiwitten, in mensen tien of meer, die assemblagelijnen in het vak voor de meeste, zo niet alle vitale functies 1. , 2 Kennis van de functie en de architectuur van deze multiprotein assemblages vereist hun bepaling in superieure kwaliteit en voldoende hoeveelheid voor een gedetailleerde analyse. Het gebrek aan vele eiwitcomplexen in cellen, met name in eukaryoten, verbiedt de winning van natieve bronnen en noodzakelijk recombinante productie. De baculovirusexpressievectorsysteem (BEV) is bijzonder nuttig gebleken voor het produceren van eukaryote eiwitten zijn, waarvan de activiteit berust vaak post-translationele processing die andere gebruikelijke expressiesystemen kunnen vaakgeen ondersteuning. 3 BEV gebruik een recombinant baculovirus waarin het gen van interesse is ingevoegd insecten celkweken die op hun beurt het gekozen eiwit infecteren. MultiBac is een BEV die in het bijzonder is ontworpen voor de productie van eukaryotische eiwitcomplexen die veel subeenheden bevatten. 4 Een essentiële voorwaarde voor efficiënte productie van eiwitten en hun complexen stabielere protocollen voor alle bij een expressie experiment die ideaal kan worden geïmplementeerd als stappen standard operating procedures (SOP's) en volgde ook door niet-gespecialiseerde gebruikers betrekkelijk gemakkelijk. De MultiBac platform op het European Molecular Biology Laboratory (EMBL) maakt gebruik van SOP's voor alle betrokkenen in een multi-eiwitcomplex uitdrukking experiment stappen, te beginnen met het inbrengen van de genen in een aangelegde baculovirale genoom geoptimaliseerd voor heterologe eiwitproductie eigenschappen aan kleinschalige analyse van het eiwit exemplaren geproduceerd. 5-8 Het platformwordt geïnstalleerd in een open access-modus bij EMBL Grenoble en heeft vele wetenschappers uit de academische wereld en de industrie om eiwitcomplex onderzoeksprojecten versnellen ondersteund.
Introduction
Biologische activiteit wordt gecontroleerd door vergaderingen van eiwitten en andere biomoleculen die in onderling overleg handelen om cellulaire functies katalyseren. Sprekende voorbeelden zijn de machines die de erfelijke informatie in DNA in messenger RNA transcribeert. In mensen, meer dan 100 eiwitten samenkomen in een gedefinieerd en gereguleerd proces om genen transcriberen, die grote multiprotein complexen met 10 en meer subeenheden waaronder RNA polymerase II en algemene transcriptiefactoren zoals TFIID, TFIIH en anderen. 9 Andere voorbeelden zijn de ribosoom, bestaande uit vele eiwitten en RNA moleculen, die eiwitsynthese of de nucleaire porie complex is verantwoordelijk voor shuttling biomoleculen door de nucleaire envelop in eukaryoten katalyseert. Een gedetailleerde architectuur en biochemische dissectie van nagenoeg alle multicomponent machines in de cel is essentieel om de functie te begrijpen. De structuur opheldering van prokaryote en eukaryotic ribosomen, bijvoorbeeld, vormde keurmerk gebeurtenissen waardoor ongekend inzicht in hoe deze macromoleculaire machines uitvoeren van hun aangewezen functies in de cel. 10,11
Ribosomen kan voldoende kwaliteit en kwantiteit voor gedetailleerde studie worden verkregen door zuiveren van het endogene materiaal uit gekweekte cellen, vanwege het feit dat tot 30% van de cellulaire massa uit ribosomen. RNA polymerase II reeds minder overvloedig met orden van grootte, en vele duizenden liters gistcultuur verwerkt te worden tot een gedetailleerde atomaire weergave van deze essentiële complex centraal transcriptie verkrijgen. 12 De overgrote meerderheid van de andere essentiële complexen zijn echter aanwezig veel lagere hoeveelheden in oorspronkelijke cellen, en derhalve niet voldoende worden gezuiverd uit natuurlijke bron materiaal. Om dergelijke complexen toegankelijk te gedetailleerde structurele en functionele analyse maken vereist heterologe productie met behulp van recombinant techniques.
Productie van recombinant eiwit had een grote impact op life science onderzoek. Vele eiwitten zijn recombinant geproduceerd en hun structuur en functie ontleed bij hoge resolutie. Structurele genomica programma's hebben gebruik gemaakt van de opheldering van de genomen van vele organismen aan het genproduct repertoire van gehele organismen in high-throughput mode (HT) te pakken. Duizenden eiwitstructuren zijn aldus bepaald. Tot op heden is de meest overvloedig gebruikt voor recombinant eiwitproductie geweest E. coli en vele expressiesystemen ontwikkeld en verfijnd door de jaren heterologe in deze gastheer. De plasmiden een overvloed aan functionaliteiten om eiwitproductie mogelijk in E. coli vullen hele catalogi van commerciële aanbieders.
Echter, E. coli heeft bepaalde beperkingen waardoor het ongeschikt voor veel eukaryote proteïnen te produceren en in particulaire eiwitcomplexen met vele subeenheden. Daarom heeft eiwitproductie in eukaryotische gastheren steeds meer de werkwijze van keuze in de afgelopen jaren. Een bijzonder geschikt systeem eukaryote eiwitten is het baculovirus expressie-vectorsysteem (BEV) dat steunt op een recombinant baculovirus die de heterologe genen insecten celkweken gekweekt in het laboratorium infecteren. Het MultiBac systeem is een recent ontwikkelde BEV die vooral is aangepast voor de productie van eukaryotische eiwitcomplexen met vele subeenheden (Figuur 1). MultiBac werd voor het eerst geïntroduceerd in 2004. 13 Sinds de introductie, heeft MultiBac voortdurend verfijnd en gestroomlijnd om behandeling te vereenvoudigen, te verbeteren doelproteïne kwaliteit en in het algemeen maken van het systeem toegankelijk is voor niet-gespecialiseerde gebruikers door het ontwerpen van efficiënte standard operating procedures (SOP's). 4 MultiBac is geïmplementeerd in veel laboratoria in de wereld, in academia en industrie. Aan het EMBL in Grenoble, werden transnationale toegang programma's opgezet door de Europese Commissie om deskundig opleiding op het MultiBac platform voor wetenschappers die wilden deze productie systeem te gebruiken voor het bevorderen van hun onderzoek. De structuur en functie van vele eiwit-complexen die tot dusverre niet toegankelijk waren opgehelderd door monsters geproduceerd MultiBac. 4 Hierna worden de essentiële stappen van MultiBac productie samengevat in protocollen als in werking op MultiBac faciliteit in EMBL Grenoble.
Protocol
Representative Results
Discussion
Video snap-shots in figuren 2 en 3 tonen het volledige proces van robot-assisted genereren van cDNA van multigene expressieconstructen tot aan infectie van insecten celkweken voor eiwitproductie. Nieuwe reagentia (plasmiden en virussen) en robuuste protocollen zijn ontwikkeld om een pijpleiding vertrouwen op SOP inschakelen. De gehele pipeline is geïmplementeerd als een platform technologie op het EMBL in Grenoble. De MultiBac platform is toegankelijk door veel wetenschappers van…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond en alle vroegere en huidige leden van de Berger laboratorium voor hulp en advies. De MultiBac platform en de ontwikkeling ervan zijn en worden mede mogelijk gemaakt door financiële instanties, waaronder de Zwitserse National Science Foundation (SNSF), de Agence Nationale de Recherche (ANR) en het Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) en de Europese Commissie (EC) in kaderprogramma's (KP) 6 en 7. Steun voor transnationale toegang wordt verschaft door de EC FP7 projecten P-CUBE ( www.p-cube.eu ) en BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). Het Franse ministerie van Wetenschap is vooral erkend voor het ondersteunen van de MultiBac platform op het EMBL via de Investissement d'Avenir project Frisbi.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. The molecular sociology of the cell. Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).
- Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
- Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).
- Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).
- Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells. J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).
- Thomas, M. C., Chiang, C. M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).
- Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. Atomic structures of the eukaryotic ribosome. Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).
- Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. 288 (5466), 640-649 (2000).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).
- Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering. Nat. Protocols. , (2009).
- Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).
- Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, Structure of the mitotic checkpoint complex. Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).
- Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a. Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).
