Den MultiBac Protein Complex Production Platform på EMBL
Summary
Protein-komplekser katalyserer vigtige cellulære funktioner. Detaljeret funktionel og strukturel karakterisering af mange essentielle komplekser kræver rekombinant produktion. MultiBac er et baculovirus / insektcelle-systemet særligt skræddersyet til at udtrykke eukaryote proteiner og deres komplekser. MultiBac blev gennemført som en åben adgang platform og standard operationelle procedurer er udviklet til at maksimere sin nytte.
Abstract
Proteomics forskning afslørede imponerende kompleksitet eukaryote proteomer i hidtil usete detaljer. Det er nu et almindeligt accepteret begreb, at proteiner i celler hovedsagelig eksisterer ikke som isolerede enheder, men udøver deres biologiske aktivitet i forbindelse med mange andre proteiner, i mennesker ti eller mere, danner samlebånd i cellen for de fleste hvis ikke alle vitale funktioner. 1. , 2 Kendskab til funktion og arkitektur af disse multiprotein forsamlinger kræver deres bestemmelse i fineste kvalitet og tilstrækkelig mængde til detaljeret analyse. Knapheden på mange protein komplekser i cellerne, især i eukaryoter, forbyder deres udvinding fra native kilder, og nødvendiggør rekombinant produktion. Baculovirus ekspressionsvektor systemet (BEVS) har vist sig at være særlig anvendelig til at producere eukaryote proteiner, hvis aktivitet ofte afhængig posttranslationel processering som andre almindeligt anvendte ekspressionssystemer ofte kanikke understøtter. 3 BEVS bruge en rekombinant baculovirus, hvori genet af interesse blev indsat til at inficere insekt-cellekulturer, som igen producerer proteinet af valg. MultiBac er en BEVS der har været særligt skræddersyet til produktion af eukaryote protein komplekser, der indeholder mange underenheder. 4 A afgørende forudsætning for effektiv produktion af proteiner og deres komplekser er robuste protokoller for alle trin involveret i et udtryk eksperiment, der ideelt set kan gennemføres som standard operationelle procedurer (SOP) og efterfulgt også af ikke-specialiserede brugere med sammenlignende problemer. Den MultiBac platform på European Molecular Biology Laboratory (EMBL) bruger standardforskrifter for alle trin involveret i en multiprotein komplekst udtryk eksperiment, startende fra indsættelse af gener i en manipuleret baculoviral genom optimeret til heterologe protein produktion egenskaber små analyse af proteinet prøver produceret. 5-8 Platformensinstalleres i en åben adgang tilstand ved EMBL Grenoble og har støttet mange videnskabsfolk fra den akademiske verden og industrien til at fremskynde protein komplekse forskningsprojekter.
Introduction
Biologisk aktivitet styres af samlinger af proteiner og andre biomolekyler, der virker i fællesskab at katalysere cellulære funktioner. Bemærkelsesværdige eksempler omfatter maskiner, der transcribes den arvelige oplysningerne i DNA i messenger RNA. Hos mennesker kommer mere end 100 proteiner sammen i en defineret og reguleret proces at transskribere gener, danner store multiprotein komplekser med 10 og flere underenheder, herunder RNA-polymerase II, og de generelle transkriptionsfaktorer såsom TFIID, TFIIH og andre. 9 Andre eksempler er ribosomet, bestående af mange proteiner og RNA-molekyler, der katalyserer proteinsyntese, eller den nukleare pore kompleks, der er ansvarlig for shuttling biomolekyler gennem kernemembranen i eukaryoter. En detaljeret arkitektonisk og biokemiske dissektion af væsentlige alt flerkomponent-maskiner i cellen er vigtigt at forstå deres funktion. Strukturen belysning af prokaryote og eukaryotic ribosomer, for eksempel, udgjorde kendetegnende begivenheder der giver en hidtil uset indblik i, hvordan disse makromolekylære maskiner udfører deres udpegede funktioner i cellen. 10,11
Ribosomer kan opnås i tilstrækkelig kvalitet og mængde for detaljeret undersøgelse ved oprensning af endogent materiale fra dyrkede celler, på grund af det faktum, at op til 30% af den cellulære masse består af ribosomer. RNA-polymerase II er allerede mindre rigelige af størrelsesordener, og mange tusinde liter af gær kultur skulle behandles for at få en detaljeret atomar baggrund af denne afgørende kompleks centralt for transkription. 12. Det overvældende flertal af de andre væsentlige komplekser er dog til stede i meget lavere beløb i native celler, og dermed ikke kan renses tilstrækkeligt fra native kildemateriale. At gøre sådanne komplekser tilgængelige for detaljeret strukturel og funktionel analyse kræver heterolog produktion ved hjælp af rekombinant techniques.
Rekombinant protein produktion haft en stor indflydelse på livet forskning. Mange proteiner blev produceret rekombinant, og deres struktur og funktion dissekeret høj opløsning. Strukturel genomforskning programmer har draget fordel af en belysning af genomer af mange organismer at løse genproduktet repertoire af hele organismer i high-throughput (HT) mode. Tusinder af protein strukturer er således blevet bestemt. Til dato har det mest prolifically anvendte system til produktion af rekombinante proteiner blevet E. coli, og mange ekspressionssystemer er blevet udviklet og forfinet gennem årene for heterolog produktion i denne vært. De plasmider huser et væld af funktionaliteter for at aktivere protein produktion i E. coli fylder hele kataloger af kommercielle udbydere.
Men E. coli har visse begrænsninger, som gør det uegnet til at producere mange eukaryote proteiner, og i partikulære protein komplekser med mange underenheder. Derfor har proteinproduktion i eukaryote værter blevet stadig den foretrukne metode i de seneste år. Et særligt velegnet system til at producere eukaryote proteiner er baculovirusekspressionsvektor systemet (BEVS), der bygger på en rekombinant baculovirus bærer de heterologe gener til at inficere insekt cellekulturer dyrket i laboratoriet. Det MultiBac systemet er en mere nyligt udviklede BEVS der er særligt tilpasset til fremstilling af eukaryote protein komplekser med mange underenheder (figur 1). MultiBac blev først indført i 2004. 13. Siden lanceringen har MultiBac løbende blevet forfinet og strømlinet at forenkle håndteringen, forbedre target protein kvalitet og generelt gøre systemet tilgængeligt for ikke-specialiserede brugere ved at designe effektive standardprocedurer (SOP). 4 MultiBac er blevet implementeret i mange laboratorier verden over, i academia og industri. På EMBL i Grenoble blev transnationale adgang til programmer indført af Europa-Kommissionen til at yde sagkyndig uddannelse på MultiBac platform for videnskabsfolk, der ønskede at bruge dette produktionssystem for at fremme deres forskning. Struktur og funktion af mange protein komplekser, der var hidtil ikke er tilgængelige blev belyst ved hjælp af prøver produceret med MultiBac. 4. I det følgende er de væsentlige skridt i MultiBac produktion opsummeret i protokoller, som de er i drift på MultiBac facilitet på EMBL Grenoble.
Protocol
Representative Results
Discussion
Video snapshot i figurerne 2 og 3 viser hele processen fra robot-assisteret generation fra cDNA fra multigenfamilie ekspressionskonstruktionerne hele vejen til infektion af insekt cellekulturer til proteinproduktion. Nye reagenser (plasmider og virus) og robuste protokoller er blevet udviklet til at muliggøre en rørledning afhængige standardforskrifter. Hele pipeline er blevet implementeret som en platform teknologi på EMBL i Grenoble. Den MultiBac platformen er blevet besøgt af ma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond og alle tidligere og nuværende medlemmer af Berger laboratorium for hjælp og rådgivning. Den MultiBac platform og dets udvikling har været og er generøst støttet af finansieringsorganer, herunder den schweiziske National Science Foundation (SNSF), Agence Nationale de Recherche (ANR), og Centre National de Recherche Scientifique (CNRS), og Europa-Kommissionen (EF) i rammeprogrammer (RP) 6 og 7. Støtte til tværnational adgang leveres af EF FP7-projekter P-Cube ( www.p-cube.eu ) og BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). Det franske Videnskabsministeriet er især anerkendt for at støtte MultiBac platform ved EMBL gennem Investissement d'Avenir projekt FRISBI.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. The molecular sociology of the cell. Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).
- Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
- Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).
- Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).
- Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells. J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).
- Thomas, M. C., Chiang, C. M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).
- Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. Atomic structures of the eukaryotic ribosome. Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).
- Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. 288 (5466), 640-649 (2000).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).
- Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering. Nat. Protocols. , (2009).
- Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).
- Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, Structure of the mitotic checkpoint complex. Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).
- Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a. Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).
