A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL
Summary
Complexos proteína de catalisar as funções celulares importantes. Caracterização estrutural e funcional detalhada de muitos complexos essenciais exige a produção recombinante. MultiBac é um sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para a expressão de proteínas eucarióticas e seus complexos. MultiBac foi implementado como uma plataforma de acesso aberto, e procedimentos operacionais padrão desenvolvidos para maximizar a sua utilidade.
Abstract
Proteômica pesquisa revelou a complexidade impressionante de proteomas eucarióticas em detalhes sem precedentes. É agora um conceito geralmente aceite de que as proteínas nas células principalmente não existem como entidades isoladas, mas exercem a sua actividade biológica, em associação com muitas outras proteínas, em seres humanos dez ou mais, formando as linhas de montagem na célula para a maior parte, se não todas as funções vitais. 1 , 2 Conhecimento da função e arquitetura destes conjuntos multiprotein requer sua prestação em qualidade superior e quantidade suficiente para uma análise detalhada. A escassez de muitos complexos de proteínas nas células, em particular em eucariotas, impede a sua extracção a partir de fontes nativas, e requer a produção recombinante. O sistema de vector de expressão de baculovirus (BEVS) provou ser particularmente útil para a produção de proteínas eucarióticas, a actividade da qual assenta o processamento pós-translacional que outros sistemas de expressão vulgarmente utilizados, muitas vezes podenão suporta. três BEVS usar um baculovirus recombinante no qual o gene de interesse foi introduzido para infectar culturas de células de insectos, que por sua vez produzem a proteína de escolha. MultiBac BEVS é um que foi especialmente adaptado para a produção de complexos de proteínas eucarióticas que contêm várias subunidades. 4 Um pré-requisito importante para a produção eficiente de proteínas e os seus complexos são protocolos robustos para todos os passos envolvidos na expressão de uma experiência que, idealmente, pode ser implementado como procedimentos operacionais padronizados (POPs) e seguido também por usuários não-especializados, com relativa facilidade. A plataforma MultiBac no Laboratório de Biologia Molecular Europeu (EMBL) utiliza PHF para todos os passos envolvidos na expressão de um complexo multiproteico experiência, começando a partir da inserção dos genes num genoma de baculovírus engenharia optimizado para as propriedades de produção de proteínas heterólogas a análise de pequena escala da proteína exemplares produzidos. 5-8 a plataformaestá instalado em um modo de acesso aberto no EMBL Grenoble e apoiou muitos cientistas de universidades e empresas para acelerar projetos de pesquisa complexos protéicos.
Introduction
A actividade biológica é controlada pela montagem de proteínas e outras biomoléculas que agem em conjunto para catalisar as funções celulares. Exemplos notáveis incluem a maquinaria que transcreve a informação hereditária contida no DNA em RNA mensageiro. Nos seres humanos, mais de 100 proteínas em conjunto com um processo definido e regulado para transcrever os genes, formando grandes complexos multiproteicos com 10 e mais subunidades, incluindo a RNA polimerase II e os factores de transcrição gerais, como TFIID, TFIIH e outros. 9 Outros exemplos são o ribossoma, que consiste em muitas proteínas e moléculas de ARN que catalisa a síntese de proteínas, ou o complexo do poro nuclear, que é responsável pelo transporte biomoléculas através do envelope nuclear em eucariotas. A dissecção de arquitetura e bioquímica detalhada de essencialmente todas as máquinas com múltiplos componentes da célula é vital para compreender a sua função. A elucidação da estrutura de procariotas e eukarribossomos yotic, por exemplo, constituíram eventos marcantes produzindo uma visão sem precedentes sobre a forma como estas máquinas macromoleculares realizar suas funções designadas na célula 10,11.
Os ribossomas podem ser obtidos em termos de qualidade e quantidade suficientes para um estudo detalhado por purificação do material endógeno a partir de células cultivadas, devido ao fato de que até 30% da massa celular consiste de ribossomas. RNA polimerase II já é menos abundante em ordens de magnitude e, em muitos milhares de litros de cultura de levedura teve de ser processada para se obter uma vista atómica detalhada deste complexo central e essencial para a transcrição. 12 A esmagadora maioria dos outros complexos essenciais estão presentes no entanto quantidades muito baixas em células nativas, e, portanto, não pode ser purificada de forma adequada a partir de material de origem nativa. Para produzir tais complexos acessíveis à análise estrutural e funcional detalhada exige a produção heteróloga recombinante usando TEchniques.
Produção de proteínas recombinantes teve um grande impacto na pesquisa de ciências da vida. Muitas proteínas foram produzidos de forma recombinante, e a sua estrutura e função dissecado na alta resolução. Programas de genômica estrutural aproveitaram a elucidação dos genomas de muitos organismos para enfrentar o repertório de organismos inteiros no modo de alto rendimento (HT), produto do gene. Milhares de estruturas proteicas foram assim determinados. Até à data, o sistema mais usado para prolífica produção de proteínas recombinantes tem sido E. coli, e diversos sistemas de expressão têm sido desenvolvidos e refinada ao longo dos anos, para a produção heteróloga neste hospedeiro. Os plasmídeos contendo uma variedade de funcionalidades, para permitir a produção de proteínas em E. coli preencher catálogos inteiros de provedores comerciais.
No entanto, E. coli tem certas limitações que o tornam inadequado para a produção de muitas proteínas eucarióticas e em pcomplexos de proteínas articulares com várias subunidades. Por conseguinte, a produção de proteínas em hospedeiros eucarióticos tornou-se cada vez mais o método de escolha nos últimos anos. Um sistema particularmente bem adequado para a produção de proteínas eucarióticas é o sistema de vector de expressão de baculovirus (BEVS) que depende de um baculovírus recombinante portador dos genes heterólogos para infectar culturas de células de insectos cultivadas em laboratório. O sistema é um MultiBac BEVS desenvolvidos mais recentemente, que é particularmente adaptado para a produção de complexos de proteínas eucarióticas com várias subunidades (figura 1). MultiBac foi introduzido pela primeira vez em 2004. 13 Desde a sua introdução, MultiBac tem sido continuamente refinado e fluxo alinhada para simplificar a manipulação, melhorar a qualidade da proteína-alvo e, geralmente, tornando o sistema acessível a usuários não especialistas através da concepção de procedimentos operacionais padronizados (POPs eficientes). 4 MultiBac foi implementada em muitos laboratórios em todo o mundo, em acAdémia e indústria. No EMBL em Grenoble, programas de acesso transnacionais foram postas em prática pela Comissão Europeia para fornecer treinamento especializado na plataforma MultiBac para cientistas que pretendiam usar este sistema de produção para avançar suas pesquisas. A estrutura e função de muitos complexos de proteínas, que até agora não eram acessíveis foi elucidada utilizando amostras produzidas com MultiBac. 4 No seguinte, as etapas de produção essenciais MultiBac estão resumidos nos protocolos como estão em operação na instalação MultiBac no EMBL Grenoble.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vídeo instantâneos nas Figuras 2 e 3 ilustram o processo inteiro de produção assistida por robô a partir do cDNA de expressão constrói multigenes todo o caminho para a infecção de culturas de células de insectos para a produção de proteína. Novos reagentes (plasmídeos e vírus) e os protocolos robustos têm sido desenvolvidos para permitir que uma conduta depender de PHF. Todo o oleoduto tem sido implementado como uma tecnologia de plataforma na EMBL, em Grenoble. A plataf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond e todos os membros atuais e anteriores do laboratório de Berger para ajuda e conselhos. A plataforma MultiBac e seu desenvolvimento têm sido e são generosamente apoiados por agências de financiamento, incluindo a Swiss National Science Foundation (SNSF), a Agence National de Recherche (ANR) e do Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) e da Comissão Europeia (CE) em programas-quadro (FP) 6 e 7. Apoio ao acesso transnacional é fornecido pelos projetos FP7 CE P-CUBE ( www.p-cube.eu ) e BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). O Ministério da Ciência é particularmente reconhecido por apoiar a plataforma MultiBac no EMBL através do Investissement d'Avenir projeto Frisbi.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
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