MultiBac белкового комплекса добывающей платформы на EMBL
Summary
Белковые комплексы катализируют ключевые клеточные функции. Подробные функциональные и структурные характеристики многих важных комплексов требует рекомбинантного производства. MultiBac является бакуловирус / клетка насекомого разработана специально для выражения эукариотических белков и их комплексов. MultiBac был реализован как открытая платформа доступа, и стандартных оперативных процедур разработаны для максимального использования ее полезности.
Abstract
Протеомики исследования показали впечатляющие сложности эукариотических протеомов в беспрецедентных деталях. Теперь это общепринятое понятие, что белков в клетках основном существуют не как изолированные сущности, но проявляют свою биологическую активность в сотрудничестве со многими другими белками, у человека десять и более, образуя сборочных линий в клетке для большинства, если не всех жизненно важных функций. 1 , 2 Знание функции и архитектура этих мультибелковых сборки требует их положение высшего качества и в достаточном количестве для детального анализа. Недостатком многих белковых комплексов в клетках, в частности у эукариот, запрещает их извлечения из природных источников, и требует рекомбинантной продукции. Вектор экспрессии бакуловируса системы (BEVs) оказалась особенно полезной для производства белков эукариот, деятельность которых зачастую зависит от посттрансляционное обработки, которые обычно используются другие системы экспрессии часто можетне поддерживают. 3 BEVs использовать рекомбинантный бакуловирус, в который ген был вставлен инфицировать насекомое клеточных культур, в свою очередь продуцировать белок выбора. MultiBac является BEVs, которая была разработана специально для производства эукариотических белковых комплексов, которые содержат множество субъединиц. 4 жизненно важным условием для эффективного производства белков и их комплексов являются надежными протоколов для всех операций, связанных выражение эксперимент, который идеально может быть реализован как стандартные операционные процедуры (СОП) и последуют и неспециалисту пользователей сравнительно легко. MultiBac платформы на Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL) использует СОП для всех операций, связанных мультибелковый сложный эксперимент выражения, начиная с введения генов в геноме инженерных бакуловирусные оптимизирован для гетерологичными свойствами производства белка мелким анализа белка образцов, полученных. 5-8 платформыустановлен в открытом доступе в режиме EMBL Гренобля и поддержал многие ученые из академических и промышленных ускорить белковый комплекс исследовательских проектов.
Introduction
Биологическая активность контролируется сборки белков и других биомолекул, которые действуют совместно, чтобы катализировать клеточных функций. Известные примеры включают механизм, который расшифровывает наследственной информации, содержащейся в ДНК в РНК. У людей, более 100 белков собрались вместе в определенной и регулируемым процессом, чтобы расшифровать гены, образуя крупные комплексы мультибелковых с 10 и более субъединиц РНК-полимеразы в том числе II и общих факторов транскрипции, таких как TFIID, TFIIH и другие. 9 Другие примеры рибосомы, состоящие из многих белков и РНК, который катализирует синтез белка, или ядерного комплекса пор, который отвечает за челночные биомолекул посредством ядерной оболочки у эукариот. Подробные архитектурные и биохимические вскрытия практически всех многокомпонентных машин в клетке важно понять их функции. Выяснение структуры прокариотических и eukaryotic рибосомы, например, составили отличительной чертой событий получая беспрецедентное понимание, как эти машины макромолекулярными выполнять свои определенными функциями в клетке. 10,11
Рибосомы могут быть получены достаточные количества и качества для детального исследования путем очистки эндогенного материала из культивируемых клеток, в связи с тем, что до 30% от клеточной массы состоит из рибосом. РНК-полимераза II уже менее обильными на порядки, и многие тысячи литров дрожжевой культуры должны были быть обработаны для получения детальной атомной связи с этим необходимо, чтобы комплекс центральной транскрипции. 12 Подавляющее большинство других важных комплексов, однако в настоящее значительно ниже суммы в нативных клетках, и таким образом не может быть очищена от родных адекватно исходный материал. Оказывать такие комплексы доступными для детального структурного и функционального анализа требует гетерологичными производства с помощью рекомбинантных TEchniques.
Рекомбинантного белка оказала большое влияние на жизни научных исследований. Многие белки были получены рекомбинантным, а их структура и функция расчлененный с высоким разрешением. Структурной геномики программ воспользовались выяснение геномы многих организмов для решения репертуаром генов произведения целых организмов в высокой пропускной способности (HT) режиме. Тысячи белковых структур таким образом, были определены. На сегодняшний день наиболее плодотворно использовать системы для производства рекомбинантных белков была E. палочка, и многие системы экспрессии были разработаны и уточнены в течение многих лет для гетерологичной производства в этой хоста. Плазмиды, несущие множество функциональных чтобы белка в E. палочка заполнить все каталоги коммерческих провайдеров.
Тем не менее, E. палочка имеет определенные ограничения, которые делают его непригодным для производства многих эукариотических белков и в рсуставной белковые комплексы со многими субъединиц. Поэтому белка в эукариотических хозяев становится все более предпочтительным методом в последние годы. Особенно хорошо подходит система для получения эукариотических белков вектор экспрессии бакуловируса системы (BEVs), которая опирается на рекомбинантного бакуловируса проведение гетерологичных генов инфицировать насекомое клеточных культур выращивали в лаборатории. Система MultiBac является более недавно разработанных BEVs который особенно приспособлены для производства эукариотических белковые комплексы со многими субъединиц (рис. 1). MultiBac был впервые представлен в 2004 году. +13 С момента своего появления, MultiBac была постоянно совершенствуется и усовершенствованной для упрощения обработки, улучшения качества белка-мишени и в целом делает систему доступной для неспециалиста пользователей путем разработки эффективных стандартных операционных процедур (СОП). 4 MultiBac была реализована во многих лабораториях во всем мире, в соотademia и промышленности. На EMBL в Гренобле, транснациональных программах доступа были введены в действие Европейской комиссии обеспечить подготовку специалистов в MultiBac платформы для ученых, которые хотели бы использовать эту систему производства для продвижения своих исследований. Структура и функции многих белковых комплексов, которые были до сих пор не доступны было выяснено использованием образцов, полученных с MultiBac. 4 В дальнейшем основные этапы производства MultiBac сведены в протоколы, как в эксплуатацию в MultiBac объекта в EMBL Гренобле.
Protocol
Representative Results
Discussion
Видео оснастку выстрелов на Фиг.2 и 3 иллюстрируют весь процесс от роботизированной поколения из кДНК мультигенное экспрессирующие конструкции, вплоть до заражения насекомыми культур клеток для продукции белка. Новые реагенты (плазмиды и вирусы) и надежные протоколы…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Кристоф Bieniossek, Саймон Trowitzsch, Даниэль Фицджеральд, Yuichiro Такаги, Кристиан Schaffitzel, Ивонн Хунцикера, Тимоти Ричмонд и всех прошлых и настоящих членов лаборатории Бергер за помощью и советом. MultiBac платформы и ее развития были и при щедрой поддержке финансирования учреждений, включая Швейцарского национального научного фонда (SNSF), Национального агентства по исследованиям (ANR) и Национального центра Научных Исследований (CNRS) и Европейская комиссия (ЕК) В рамочной программы (FP) 6 и 7. Поддержка транснационального доступа обеспечивается проектов ЕС FP7 P-CUBE ( www.p-cube.eu ) и BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). Французское министерство науки, в частности, признал за поддержку MultiBac платформы на EMBL через Investissement d'Avenir Frisbi проекта.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. The molecular sociology of the cell. Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).
- Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
- Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).
- Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).
- Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells. J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).
- Thomas, M. C., Chiang, C. M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).
- Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. Atomic structures of the eukaryotic ribosome. Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).
- Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. 288 (5466), 640-649 (2000).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).
- Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering. Nat. Protocols. , (2009).
- Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).
- Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, Structure of the mitotic checkpoint complex. Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).
- Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a. Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).
